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A. Material Biológico Un lote de 100 papayas variedad Maradol cosechadas en un
estado de madurez verde-maduro (15-25% de color amarillo en cáscara) se lavaron
y desinfectaron con 200 ppm de cloro comercial y 25 g/L de captán
(dicarboximida) por inmersión de 1 minuto como fungicida, luego se secaron y se
seleccionaron 50 frutos con apariencia uniforme, tamaño, ausencia de daños y
enfermedades. De estas 50 papayas se seleccionaron 23 frutos y se colocaron en
contenedores de acero inoxidable herméticamente cerrados en una cámara de
refrigeración a 20 ºC, donde se les aplicó 300 ppb de 1-MCP durante 12 horas.
Al término de las 12 horas de tratamiento del 1-MCP, los frutos tratados se
sacaron de los contenedores y se almacenaron junto con los frutos testigo en
una cámara a 20 ºC.
Se efectuaron los muestreos de calidad cada 3 días, durante 12 días. Se tomaron
3 frutos de forma aleatoria a los que se determinaron los parámetros de calidad
y actividad enzimática de la poligalacturonasa y ß-galactosidasa. B. Parámetros
de Calidad 1. Pérdida de peso Las papayas se pesaron al inicio del experimento
utilizando una balanza analítica marca Sartorius, (modelo BP 3100 P),
posteriormente se pesaron cada tres días. Los resultados se presentan en
porcentaje de pérdida de peso con respecto al día cero (Pérez, 2003). 2.
Firmeza La firmeza se determinó en el área ecuatorial y longitudinal del fruto
de papaya utilizando un penetrómetro digital marca Chatillon (modelo DFG-50),
el cuál mide la presión necesaria para forzar una punta de inmersión de tamaño
específico a penetrar en la pulpa del fruto.
Los valores se registraron en Newtons (N) y se tomaron 4 mediciones en cada
fruto (Pérez, 2003). 5 3. Color en cáscara y pulpa Para determinar el ángulo de
color (ºHue), el cual se define como el arc Tan b*/a*, se utilizó un
colorímetro marca Minolta (modelo CR-300), el cual considera dimensiones de
tri-estímulo en el sistema mediante notaciones de luminosidad, color de a* y
b*. Se tomaron 4 mediciones por fruto en cáscara para el color externo. Por
otra parte, para el color interno o de la pulpa, se cortaron los frutos
longitudinalmente y se realizaron 4 mediciones en la pulpa (Pereda, 2006). C.
Obtención de Extractos Proteínicos La extracción de las enzimas se realizó
mediante el método de Moore y Bennett (1994) con modificaciones. Todas las
etapas de la extracción de las enzimas se realizaron a 4 °C. A 10 g de fruto de
papaya testigo y tratada con 1- MCP por muestreo, se le agregaron 10 mL de
?buffer? de extracción a 4 °C [acetato de sodio 0.1 M, pH 5, NaCl 1.0 M y PVPP
1% (p/v)], se molieron por 3 minutos en un homogeneizador de tejidos marca
Janke & Kunkel (modelo Cary 1E).
El sobrenadante se recuperó mediante centrifugación a 10,000 g durante 15
minutos empleando una centrífuga marca Termo (modelo IEC multi RF), y se filtró
usando papel Miracloth. El sobrenadante filtrado se dializó contra buffer de
acetato 0.05 M pH 5 utilizando membrana con tamaño de poro de 6 – 8 kDa a 4 ºC.
Al dializado obtenido se le denominó extracto proteínico. D. Actividad
Enzimática 1. Poligalacturonasa La actividad de la PG se determinó mediante el
método de Gross (1982). La mezcla de reacción consistió de 180 µL de ?buffer?
de acetato de sodio 50 µM, pH 5.0, ácido poligalacturónico 0.2% (p/v) como
sustrato y 20 µL de extracto de crudo de enzima.
Enseguida la mezcla de reacción contenida en un tubo de ensayo se incubó en un
baño con agitación marca Precision (modelo 51221080) a 37 °C durante 2 horas,
tomando alícuotas de 200 µL cada 30 minutos iniciando 6 con el tiempo cero. La
reacción enzimática se paró al colocar las alícuotas en tubos de ensayo
conteniendo 1 mL de ?buffer? de boratos 0.1 M, pH 9.0 y 0.2 mL del colorante
2-cianoacetamida al 1% (p/v). Se mezclaron en el Vortex, y se colocaron en agua
en ebullición por 10 minutos. Una vez que los tubos se enfriaron a temperatura
ambiente, se midió la absorbancia a 276 nm usando el espectrofotómetro UV/Vis.
Se realizó una curva de calibración utilizando ácido Dgalacturónico como
estándar y como blanco el valor de absorbancia a tiempo cero de reacción. 2.
ß-Galactosidasa La determinación de la actividad de la ß-galactosidasa se
realizó siguiendo la técnica de Ali et al. (1998). Se mezclaron muy bien 150 µL
de extracto enzimático crudo con 1.5 mL de solución de sustrato
p-nitrofenil-ß-Dgalactopiranosido [acetato de sodio 0.1 M, pH 5,
p-nitrofenil-ß-D-galactopiranosido 13 mM, BSA 0.05% (p/v)] a 37 °C por 20
minutos y con agitación suave en un baño con agitación marca Precision (modelo
51221080), se tomaron alícuotas de 200 µL iniciando con el tiempo 0. La
reacción enzimática se detuvo mediante la adición 1 mL de hidróxido de amonio
7% (p/v), y enseguida se leyó la absorbancia a 415 nm de la mezcla final de
reacción empleando el espectrofotómetro UV/Vis. Se elaboró una curva de
calibración utilizando p-nitrofenol como estándar y como blanco se usó el valor
de absorbancia a tiempo cero de reacción. E. Análisis Estadístico El análisis
de varianza se efectuó usando un diseño experimental completamente al azar
empleando la prueba t-student (a = 0.05) para la comparación de medias
(Montgomery, 2004).
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. Parámetros de Calidad 1. Pérdida de peso El peso en
los frutos de papaya disminuyó constantemente a lo largo del tiempo de
almacenamiento (Figura 1), siendo los frutos tratados los que presentaron menor
pérdida de peso al final del experimento.
significativas en la pérdida de peso entre las papayas control y las tratadas
con el inhibidor. Sin embargo, en el día 9 se presentaron diferencias
estadísticamente significativas entre los frutos tratados y los control con una
pérdida de peso de 4.7 y 5.8% respectivamente, Finalmente en el día 12 la
diferencia fue más notoria, con valores de pérdida de peso de 7% para frutos
tratados con 1-MCP y 10% para los frutos control. Estos resultados son
consistentes con lo obtenido por Pérez (2003), el cual reporta que frutos de
papaya Maradol tratados con 250 ppb de 1-MCP presentaron menor pérdida de peso
después de 12 días, con un 4.84% comparados con los frutos control, que fue de
6.08%. En otras variedades de papaya, tales como Sunrise Solo, se observa que
al almacenarlas a 18 ºC por un período de 8 días y con una humedad relativa del
90% se pierde cerca del 8% del peso con respecto al día inicial, siendo menor
la pérdida de peso comparada con los datos obtenidos en nuestra investigación
(Manrique y Lajolo, 2004). Estudios realizados en aguacate y ciruela, muestran
que se pierde menor peso en los frutos tratados con 1-MCP que en los frutos sin
tratar, mientras que en tomate no se observan diferencias de pérdida de peso
entre los frutos (Watkins, 2006).
La disminución en el peso de los frutos durante el período de poscosecha es el
resultado de la pérdida de agua por transpiración (Manrique y Lajolo, 2004). La
pérdida de peso se puede considerar como una pérdida económica, ya que a
ciertos niveles puede afectar la apariencia visual del fruto fresco, provocando
que se tornen marchitos y sean poco atractivos para el consumidor. Una pérdida
de peso del 5% puede afectar la apariencia visual (Carrillo, 2003). 8 a a a a b
b a a 0 2 4 6 8 10 12 0 3 6 9 12 Tiempo de almacenamiento (días) Pérdida de
peso (%) Control 1-MCP Figura 1. Por ciento de pérdida de peso en frutos de
papaya Maradol tratados con 300 ppb de 1-MCP y frutos control almacenados a 20
ºC. Las letras distintas indican diferencias significativas entre las medias (a
= 0.05).
2. Firmeza La firmeza tendió a disminuir en los frutos control durante su
almacenamiento conforme transcurrió el proceso de maduración, mientras que los
frutos tratados con el inhibidor no presentaron cambios considerables en la
firmeza (Figura 2). Las papayas en el día en que fueron cosechadas (día 0),
presentaron un valor de firmeza de 144.17 N para frutos control y frutos
tratados con 1-MCP sin presentar diferencias estadísticas. Sin embargo, en los
frutos no tratados, la firmeza disminuyó hasta 105 N en el día 3. La caída más
pronunciada se observó en el día 6 con un valor de 17 N que representó el 88%
de la firmeza total con 9 respecto al día 0. En los días 9 y 12 la firmeza
siguió decreciendo aunque a menor velocidad, llegando a 10 y 8 N
respectivamente. La firmeza de los frutos tratados con 1-MCP se conservó casi
constante a lo largo del experimento, manteniéndose en un rango de 144 y 156 N.
A partir del muestreo del día 3, el estadístico mostró diferencias
significativas entre los frutos tratados con 1-MCP y el control. En 1995, Lazan
et al. midieron la firmeza de frutos de papaya variedad Eksotika cada 2 días
por un periodo de 10 días. Estos investigadores reportaron un valor de firmeza
inicial de 107.8 N y uno de 3.9 N al final del experimento, presentándose la
mayor pérdida de firmeza entre los días 6 y 8, que representó el 59% (Lazan et
al., 1995). Ergun y Huber (2004) realizaron un experimento en frutos de papaya
variedad Sunrise Solo tratados con 9 µL/L de 1-MCP, almacenados a 15 ºC, y
observaron que a los 9 días los frutos control perdieron un 52% de su firmeza
inicial, mientras que los frutos tratados con el inhibidor perdieron sólo un
30%. Pérez (2003) trabajando también con papaya Maradol tratada con 125 y 250
ppb de 1-MCP, encontró que la firmeza exhibió un comportamiento muy similar a
lo observado en nuestra investigación. Dicha variable se mantuvo al final del
experimento (12 días) entre 140 y 147 N, en contraste a los 16 N que
presentaron de firmeza los frutos no tratados. Estudios reportados por Ali et
al. (2004) para diferentes frutos muestran que la guayaba variedad Beaumont
pierde el 50% de su firmeza en 1.5 días; plátano en 3 días; mientras que
carambola y guayaba entre los 20 y los 24 días. Frutos de aguacate tratados con
1-MCP se mantienen más firmes y se ablandan con mayor lentitud comparados con
los que no tienen tratamiento alguno. En ciruela, plátano, manzana, nectarina,
durazno, tomate y pera también se retarda su ablandamiento (Watkins, 2006).
Otros experimentos realizados muestran que el 1-MCP retrasa el ablandamiento de
los tejidos en manzana por 3.4 días y en mango por 5.1 días (Blankenship y
Dole, 2003). 10 b b b b a a a a 0 30 60 90 120 150 180 0 3 6 9 12 Tiempo de
almacenamiento (días) Firmeza (N) Control 1-MCP Figura 2. Firmeza (N) de frutos
de papaya Maradol tratados con 300 ppb de 1- MCP y frutos control almacenados a
20 ºC.
Las letras distintas indican diferencias significativas entre las medias (a =
0.05). 3. Color La Figura 3 muestra los cambios de color en la cáscara y la
pulpa de los frutos de papaya tratados con 1-MCP y los frutos control. Se
observa que los frutos tratados con 1-MCP conservan el color verde en cáscara
por más tiempo, mientras que los frutos control cambian rápidamente de verde a
anaranjado. Debido a que en la papaya el tejido mesocarpio interno es más
suave, experimenta primero los cambios que ocurren durante la maduración,
comparado con el tejido mesocarpio externo. Entre los cambios más notables
están la pérdida de la firmeza y el cambio de color (Lazan et al., 1995). 11
Figura 3. Comparación de color en cáscara y pulpa de frutos de papaya Maradol
tratados con 300 ppb de 1-MCP almacenados a 20 ºC. 3.1. Color en cáscara y
pulpa Usualmente el porcentaje de coloración amarillo-anaranjado de la cáscara
de la papaya es utilizado como un criterio para establecer los diferentes
estados de maduración en estudios bioquímicos de poscosecha. En ocasiones se
puede observar cómo algunos frutos que se encuentran agrupados en el mismo
estado de maduración de acuerdo a este criterio muestran diferencias en su
firmeza (Lajolo y Manrique, 2004). Este criterio también se utiliza al momento
de cosechar los frutos y en ocasiones algunos se encuentran más maduros de lo
que indica el color de su cáscara, por lo que no es un parámetro preciso que
determine si un fruto está en su estado de madurez óptimo para ser cosechado.
El color de la cáscara obtenido en base a los valores del ángulo de matiz
obtenidos en el colorímetro Minolta, tendió a disminuir de un tono verde a un
tono amarillo-anaranjado para los frutos control, y de verde a amarillo para
los frutos tratados con 1-MCP. Las diferencias significativas se observaron a
partir del día 3. En el día 3 el cambio de color fue el más notorio, con un
12.2% para frutos control Control, Día 9 Control, Día 0 1-MCP, Día 9 12 y 5.4%
para frutos tratados con 1-MCP. En el día 6, se observó una pérdida de color de
18.6% y 10.2% para frutos control y frutos tratados con el inhibidor, y
finalmente en el día 12, 34.6% y 25.6%, respectivamente (Figura 4).
Frutos de papaya Sunrise Solo tratados con 9 µL/L de 1-MCP mostraron retraso en
la pérdida del color verde de la cáscara y en la aparición del color amarillo
(Ergun y Huber, 2004). En 2003, Pérez reporta que papaya Maradol con 250 ppb de
1-MCP presentó un comportamiento similar a nuestros resultados, donde los
porcentajes de cambio de color con respecto al día cero fueron de 22.6% para
frutos tratados y 33% para frutos control en el día 12 del experimento (Pérez,
2003). a a a a b b b b a a a a a a a a 0 10 20 30 40 0 3 6 9 12 Tiempo de
almacenamiento (días) Cambio de color (%) Control cáscara 1-MCP cáscara Control
pulpa 1-MCP pulpa Figura 4. Cambio de color de cáscara y pulpa de acuerdo al
ángulo de matiz en frutos de papaya Maradol tratados con 1-MCP y frutos control
almacenados a 20 ºC. Las letras distintas indican diferencias significativas
entre las medias (a = 0.05). 13 En diversos frutos como la ciruela, tomate y
aguacate, el 1-MCP retrasa o previene la degradación de la clorofila y la
síntesis de pigmentos tipo carotenoides, manteniendo por más tiempo el color de
la cáscara (Blankenship y Dole, 2003).
Por otra parte, el color interno o de la pulpa se mantuvo con tonalidades
naranjas entre los frutos tratados con 1-MCP y los frutos control sin presentar
diferencias significativas en todo el experimento. Los datos se mantuvieron
constantes del día 0 al día 6 con un 0% de cambio en los frutos tratados,
mientras que los frutos control aumentaron un 2.6% con respecto al valor
inicial en el día 3. En el día 9 se observaron cambios de color del 7.6% para
frutos tratados y del 13% para frutos control, y finalmente en el día 12 un
19.5% para frutos con tratamiento y 22% para los frutos control (Figura 4).
Pérez (2003) reportó en el día 12 un cambio de color en pulpa del 20% en frutos
control y del 2.6% en frutos tratados con 250 ppb de 1-MCP. B. Actividad
enzimática 1. Poligalacturonasa La actividad de la poligalacturonasa en frutos
tratados con 1-MCP se mantuvo constante con valores entre 0.020 y 0.026 µmol/mg
proteína·min durante todo el experimento (Figura 5). Estos datos constantes se
relacionan con la retención de la firmeza en los frutos tratados con el
inhibidor (Figura 2). Por otro lado, en el día 6 los frutos control mostraron
un aumento del 156% de actividad con respecto al valor inicial (0.023 µmol/mg
proteína·min) (Figura 5), observándose una pérdida de la firmeza del 88% en los
frutos control. En el día 9 la actividad continuó aumentando (185%) y
finalmente, en el día 12 se dió el incremento más drástico, 389% y una pérdida
de firmeza al final del experimento del 96% (Figura 2).
El estadístico mostró diferencias significativas entre los frutos tratados con
1-MCP y los frutos control a partir del día 6 de muestreo. Lazan et al. (1995),
realizaron un estudio con papaya variedad Eksotika almacenada a 20 ºC durante
10 días, y los datos fueron similares a los que se obtuvieron en nuestro
experimento; la actividad de la PG que reportaron 14 incrementó en el día 10
cerca del 320% con respecto al valor inicial y la pérdida de la firmeza fue del
96%. Otros experimentos realizados en una variedad de frutos climatéricos
indican que la actividad de la PG tiende a aumentar. En tomate se ha registrado
un aumento en la actividad del 252% y una pérdida de firmeza del 77% en un
periodo de 6 días; mientras que en mango, un incremento del 54% y una pérdida
de la firmeza del 98% en 10 días. Por otro lado, la actividad de la PG difiere
dependiendo de las variedades: la guayaba Beaumont presentó un aumento del 164%
y una pérdida de la firmeza del 92% en 6 días; mientras que, en la guayaba
Kampuchea la actividad incrementó 22% y perdió 60% de su firmeza en 24 días
(Ali et al., 2004). a a a a a b b b 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 3 6 9 12
Tiempo de almacenamiento (días) Actividad de Poligalacturonasa (!mol/ mg
proteína·min) Control 1-MCP Figura
5. Cambios en la actividad de poligalacturonasa durante la maduración de frutos
de papaya Maradol tratados con 1-MCP y frutos control almacenados a 20 ºC. Las
letras distintas indican diferencias significativas entre las medias (a =
0.05). 15 En el 2003, Huber et al. observaron que frutos de aguacate tratados
con 0.07 µL/L de 1-MCP inhibieron el 50% de la actividad de la PG y observaron
una ligera disminución en su ablandamiento; mientras que, una concentración de
0.45 µL/L suprimió completamente la acumulación de la PG por 12 días,
manteniendo su firmeza por un mayor tiempo (Huber et al., 2003). 2.
ß-Galactosidasa La actividad de la ß-galactosidasa fue aumentando
constantemente y alcanzando el máximo valor en el día 9 y posteriormente se
observó un descenso (Figura 6). En el día 0 los valores fueron de 0.76 µmol/mg
proteína·min. En el día 6 la actividad de ß-gal en las papayas control aumentó
53% con respecto al día cero y la firmeza descendió 88%; mientras que, la
actividad en las papayas tratadas con el inhibidor solo aumentó un 24%,
manteniéndose la firmeza de estos frutos. Los cambios más drásticos se
presentaron a partir del día 9, donde la actividad de la ß-galactosidasa de
papayas control incrementó 126% (1.8 µmol/mg proteína·min) con una pérdida de
firmeza del 93% (Figura 2), y en las papayas tratadas, el valor descendió un
22% con respecto al valor inicial (0.62 µmol/mg proteína·min), Finalmente, en
el día 12 la actividad de ß-gal en papayas control disminuyó (1.07 µmol/mg
proteína·min), con un valor del 34% con respecto al valor inicial, perdiendo el
máximo de su firmeza (96%); mientras que, en los frutos tratados, el valor de
actividad se incrementó un 18% (0.76 µmol/mg proteína·min). A partir del día 3
de muestreo se observan diferencias significativas entre los frutos tratados y
los frutos control. Lazan et al. (1995) realizó un experimento almacenando
frutos de papaya variedad Eksotika a 20 ºC por un período de 10 días y mostró
que la actividad de la ß-galactosidasa incrementa lentamente al inicio de la
maduración, con un 54% de aumento hasta el día 7 y una pérdida de la firmeza
del 17% con respecto al día cero; mientras que en las etapas finales aumenta
con mayor rapidez, 250% al final del experimento y 96% de pérdida de firmeza.
16 En general, la actividad de la ß-galactosidasa tiende a aumentar en los
frutos, pero varía marcadamente con respecto al tipo de fruto: en mango aumenta
700% con respecto al valor inicial en un periodo de 10 días, correlacionándose
con una pérdida del 98% de su firmeza inicial; y en carambola la actividad
incrementa 70% al día 24 y se observa una pérdida de firmeza del 82% (Ali et
al., 2004). a a a a b b b b 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 0 3 6 9 12 Tiempo de
almacenamiento (días) Actividad de _-galactosidasa (!mol/mg proteína·min)
Control 1-MCP Figura 6.
Cambios en la actividad de ß-galactosidasa durante la maduración de frutos de
papaya Maradol tratados con 1-MCP y frutos control almacenados a 20 ºC. Las
letras distintas indican diferencias significativas entre las medias (a =
0.05). En frutos climatéricos tratados con 1-MCP se registran valores más bajos
de actividad de ß-galactosidasa comparados a los datos observados en frutos
maduros. Al igual que la poligalacturonasa, la ß-galactosidasa también se
asocia con el ablandamiento. Frutos de pera, kiwi y durazno exhiben menor
actividad de ß-galactosidasa y una mayor firmeza (Blankenship y Dole, 2003;
Watkins, 2006).
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