La necesidad urgente por sustituir colorantes de origen sintético ha orientado a la industria de alimentos a la búsqueda de pigmentos obtenidos de fuentes naturales. La B-ficoeritrina (BPE) de origen microbiano es un colorante proteico que ha demostrado tener aplicación como pigmento en la industria alimentaria. Los protocolos existentes para la recuperación y purificación de BPE, están caracterizados por un excesivo número de etapas que dificultan la implementación comercial.
Es necesario diseñar un proceso de recuperación y purificación que permita obtener BPE de forma eficiente y con un número reducido de etapas para minimizar la pérdida del producto. Los Sistemas de Dos Fases Acuosas (SDFA) es una técnica que ha demostrado tener gran potencial para la recuperación primaria y purificación de compuestos biológicos. En este trabajo, se establecieron los parámetros para el diseño de un proceso, fácilmente escalable a nivel industrial, para la recuperación y purificación primaria de BPE producida por Porphyridium cruentum, para la industria de alimentos. Inicialmente, se obtuvo un extracto de BPE mediante maceración y una etapa de precipitación con sulfato de amonio para concentrar el extracto.
Con dicho extracto se evaluó la influencia de los parámetros del sistema, tales como relación de volúmenes de las fases (VR), longitud de línea de corte (LLC), pH y peso molecular del polietilenglicol (PM PEG) sobre la pureza de BPE. Se seleccionaron los parámetros bajo las cuales la pureza de BPE en la fase superior era favorecida. Posteriormente, con la finalidad de reducir el número de etapas y aumentar la cantidad de material a procesar, se generó un extracto crudo de BPE mediante sonicación, para evaluar el efecto del porcentaje de extracto alimentado sobre la pureza de BPE. Se realizaron estudios de la cinética de separación de las fases para facilitar el protocolo de escalamiento del proceso. Se diseño un proceso de recuperación y purificación primaria de BPE, bajo los siguientes parámetros de sistema: 29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, VR 4.5, LLC 45% p/p, pH 7 y 40% p/p extracto de BPE el cual consistió básicamente de solo 2 etapas (sonicación y SDFA). Se obtuvo un porcentaje de recuperación superior al 90% y una pureza de 3.2 en fase superior (definida como la relación de absorbancia 545nm/280nm), la cual es superior a la requerida por la industria de alimentos (= 1.0). El proceso desarrollado presenta un enorme potencial para la obtención de un colorante de origen natural para la industria de alimentos.

La creciente tendencia por el uso de pigmentos obtenidos de fuentes naturales en la industria alimentaria ha sido impulsada en los últimos años debido a los efectos adversos que ciertos colorantes de origen sintético han presentado. Las ficobiliproteínas son colorantes proteicos encontradas en la naturaleza (cianobacterias, en algas eucarióticas monocelulares biflageladas, así como en rodófitas). Las ficobiliproteínas tienen grupos prostéticos tetrapirrólicos lineales (bilinas), unidos covalentemente a residuos cisteína específicos de las proteínas (Bermejo et al, 2002; Berns and MacColl, 1989; Ritter et al, 1999). Estos complejos absorben la luz dentro de un rango amplio de longitud de onda dentro del espectro visible, por lo cual abarcan una amplia gama de colores. La B-ficoeritrina (BPE) es una ficobiliproteína de color rosa intenso, con un peso molecular de 245 kDa, que ha demostrado tener aplicación en la industria alimentaria (Bermejo et al, 2002). Ha sido utilizada para dar color a gomas de mascar, gelatinas, productos lácteos, etc. Sin embargo, el uso de pigmentos naturales ha sido frenado, en cierto grado, por la complejidad de los procesos de recuperación y purificación necesarios para su obtención. Adicionalmente, los costos relacionados con dichos procesos generalmente son elevados, debido a la gran cantidad de operaciones involucradas. El uso a nivel industrial de técnicas difícilmente escalables genera elevados costos de operación y mantenimiento, lo cual hace menos atractiva desde un punto de vista económico, la intención de producir y recuperar compuestos de esta naturaleza.
Los Sistemas de Dos Fases Acuosas (SDFA) es una técnica de recuperación y purificación primaria líquido-líquido, que ha demostrado ser eficiente en separar compuestos de naturaleza biológica (proteicos y no proteicos; Rito-Palomares, 2004). Los SDFA permiten la intensificación de los procesos de recuperación, ya que son capaces de procesar grandes cantidades de sólidos suspendidos (incluyendo restos celulares) eliminando de esta forma etapas innecesarias, tales como centrifugaciones y precipitaciones, logrando de esta forma la integración de dos o mas etapas en una sola. Adicionalmente los SDFA son relativamente económicos y fácilmente escalables, lo cual los hace candidatos ideales para formar parte de un proceso a nivel industrial.

EA pesar de que se han diseñado procesos de recuperación y purificación para la BPE, estos generalmente cuentan con un gran número de etapas que ha limitado su implementación a nivel comercial. Es necesario generar un proceso de recuperación y purificación que permita obtener BPE de forma eficiente y con un número reducido de etapas para minimizar la pérdida del producto. Los SDFA permiten la integración de etapas, lo cual se ve reflejado en un incremento en el rendimiento de recuperación del producto de interés. El elevado costo (50,000 USD/g, ProZyme Inc, 2003) que adquiere la BPE una vez que es purificada a grado analítico (Abs 545nm/280nm = 4.2) justifica el interés económico en diseñar un proceso de recuperación y purificación. En la industria alimentaria, a diferencia de la industria farmacéutica o el área médica, la pureza requerida de BPE es inferior a la analítica (pureza = 1.0). En este sector industrial, el enorme interés en los beneficios de sustituir compuestos sintéticos por naturales dentro de la formulación de los alimentos, justifica la generación de conocimiento que investigaciones como la aquí descrita representa. El diseño predictivo de un proceso de recuperación y purificación del colorante proteico de origen microbiano BPE con potencial de comercialización será posible como resultado de este trabajo.

Obtención de Muestras
Cultivo de Porphyridium cruentum Porphyridium cruentum fue cultivado en un medio previamente reportado (Bermejo et al, 2002) en una modalidad tipo lote en matraces Erlenmeyer con volumen de trabajo de 1 L, a temperatura ambiente (22 ºC – 25 ºC). La aireación del cultivo fue proporcionada por una bomba, con un flujo volumétrico de aire de 9.6 cm3/seg. El inóculo fue de 100 ml (con 0.5 gramos de biomasa en base húmeda). El alga fue crecida por 30 días aproximadamente, después de los cuales la biomasa fue recuperada mediante centrifugación a 3500 rpm por 5 minutos.
Generación del extracto de BPE
Se realizó la ruptura celular mecánica utilizando mortero, el cual se mantuvo en refrigeración. El mortero fue adicionado con biomasa húmeda, y por cada gramo de biomasa utilizada, se agregaron 4 ml de agua bidestilada y 0.98 g de polvo de vidrio.
El tiempo de maceración se estimó considerando la cantidad de biomasa utilizada, siendo este de 15 minutos por gramo. Después de la ruptura celular se centrifugó el homogenizado resultante a 3500 rpm por 5 minutos para eliminar los restos celulares. Posteriormente se llevo a cabo una precipitación con sulfato de amonio, con la finalidad de concentrar la muestra. Por cada mililitro de sobrenadante se agregaron 0.47 gramos de sulfato de amonio, se agitó hasta alcanzar la total disolución de la sal y posteriormente se centrifugó a 14000 rpm por 10 minutos. Se retiró el sobrenadante, y el precipitado se resuspendió en solución amortiguadora de sulfato de amonio (60% v/v) en fosfato de potasio 50 mM (pH 7) y azida de sodio 5 mM (ProZyme Inc, 2003).
Se guardó el extracto protegido de la luz a baja temperatura (4 ºC). Este extracto de BPE fue utilizado durante las primeras etapas experimentales (influencia de LLC, PM PEG, pH y VR). Con el afán de reducir el número de etapas necesarias para generar el extracto (y del proceso en general) se probó la sonicación como medio alterno de ruptura celular. En un tubo de vidrio se colocó biomasa húmeda y se agregaron 4 ml de agua bidestilada por cada gramo de biomasa. Se sonicó por 10 minutos por cada gramo de biomasa colocado, agitando constantemente el contenido del tubo de tal forma que se evitara la agregación de la biomasa en el fondo del tubo por efecto de la gravedad.
Al homogenizado resultante se le llamo extracto crudo de BPE y este fue alimentado directamente (incluyendo restos celulares) a los SDFA durante las etapas experimentales de porcentaje de extracto crudo alimentado y geometría del dispositivo de extracción.
Formación de los SDFA
Se utilizaron soluciones estándar de polietilénglicol (PEG) al 50% p/p y fosfato de potasio monobásico y dibásico (en una relación 7:18 respectivamente) al 40% p/p. Se preparó una solución estándar para cada peso molecular de polietilénglicol utilizado (1000, 1450, 3350 y 8000 g/gmol).
El pH de la solución de fosfatos fue ajustado mediante la adición de ácido ortofosfórico (85% v/v) o hidróxido de potasio (1 N) según fue necesario. Los sistemas (de 1 a 50g) se construyeron sobre una balanza, pesando las soluciones estándar de PEG y fosfato previamente elaboradas (en base a la composición del sistema).
Posteriormente se agregó agua bidestilada y por último el extracto crudo de BPE. El pH del sistema se ajustó en caso de ser necesario. Una vez agregada la muestra en el sistema, se agitó por inversión por 10 minutos y se centrifugó a 3500 rpm por 10 minutos para acelerar el equilibrio de las fases (excepto en el estudio de la influencia de la geometría del sistema sobre de tiempo de formación de fases).
Influencia de los parámetros de SDFA sobre la pureza de BPE
Durante la etapa experimental llevada cabo para estudiar la influencia de la LLC y el PM PEG sobre la pureza de BPE se probaron 16 sistemas en total (4 pesos moleculares de polietilénglicol con 4 diferentes LLC cada uno; ver Tabla 1). Estos sistemas fueron probados a pH 7, con un VR experimental cercano a 1. Las composiciones de dichos sistemas se muestran en la Tabla 1. Posteriormente, se seleccionó el sistema que dio la mayor pureza de BPE para cada peso molecular de polietilénglicol, para estudiar la influencia del pH (7, 8 y 9) sobre la pureza de BPE. Una vez concluido este estudio, se seleccionaron los 2 sistemas que reportaron las purezas mayores. Estos sistemas fueron utilizados para evaluar la influencia del VR sobre la pureza de BPE. La influencia de la LLC, el PM PEG, el pH y el VR sobre la pureza de BPE se estudió con una concentración de extracto de 10% p/p en el sistema. A fin de aumentar el material procesado por el SDFA (intensificación de proceso) se evaluó el efecto del aumento de la concentración de extracto crudo (10, 20, 30 y 40% p/p) en el sistema, sobre la pureza de BPE. Finalmente, se seleccionaron dispositivos de extracción con diferentes geometrías (caracterizadas por su altura/diámetro; L/D) a fin de evaluar su efecto sobre la pureza de BPE y sobre la cinética de separación de fases por sedimentación. El grado de separación de fase fue reportado utilizando el VR relativo (VR obtenido por sedimentación/ VR obtenido por centrifugación). Todos los sistemas probados se realizaron por duplicado.
Técnicas analíticas y estimación de la concentración de BPE
La pureza de BPE se determinó mediante la relación de absorbancia 545nm / 280nm. La cuantificación de proteína total se llevó a cabo mediante la técnica de Bradford (Bradford, 1976). La concentración de BPE, así como la de Aloficocianina (APC) y R-ficocianina (RPC) se estimó utilizando las lecturas de absorbancia a 565, 620 y 650 nm y el sistema de ecuaciones reportado anteriormente (Bermejo et al, 2002; Bennet y Bogorad, 1973).

El colorante BPE exhibió una clara preferencia por la fase superior rica en polímero, lo cual fue observado visualmente y comprobado por el aumento en la pureza de la BPE del extracto crudo inicial (0.5; medida como la relación de absorbancia 545nm / 280nm) con respecto a la obtenida de dicha fase (mayor a 0.5 en Tabla 1). En los sistemas probados no se detectó BPE en la fase inferior. Se observó una tendencia clara a obtener mayores purezas al utilizar sistemas con PEG de bajo peso molecular (1000 y 1450 g/gmol; Tabla 1).
Se ha reportado que el peso molecular del polímero utilizado para construir los SDFA tiene gran influencia sobre el comportamiento de partición de los solutos agregados al sistema (Albertsson et al, 1990). Esto es particularmente evidente cuando se intenta recuperar compuestos de muy alto peso molecular, como por ejemplo la BPE (245 kDa). Dos fenómenos son los responsables de este comportamiento.
El primero es la reducción del volumen libre disponible en la fase superior al aumentar el peso molecular del polímero, lo cual genera impedimento estérico que dificulta la partición de la BPE hacia la fase superior del sistema (Huddleston et al, 1991). El segundo es el aumento del carácter hidrofóbico de la fase superior al aumentar el peso molecular del polímero utilizado (Chen, 1992), lo cual causa que la BPE, siendo altamente hidrofílica (Lee, 1989), pierda afinidad por dicha fase. Tabla 1.
Efecto de la longitud de la línea de corte (LLC) sobre la pureza de BPE obtenida en fase superior de SDFA PEG –
fosfato de potasio
Sistema PEG (g/gmol) PEG
(% p/p) Fosfato
(% p/p) LLC (% p/p) Pureza BPE (545nm/280nm)
1 1000 15.6 12.6 28.3 2.7 ± 0.03
2 17.6 13.6 36.1 2.5 ± 0.03
3 19.8 14.8 38.0 2.5 ± 0.01
4 22.2 16.0 49.4 2.9 ± 0.02
5 1450 17.6 10.9 34.3 1.8 ± 0.11
6 22.2 12.1 47.0 2.3 ± 0.28
7 24.9 12.6 53.2 2.7 ± 0.02
8 26.1 13.0 55.0 2.6 ± 0.08
9 3350 16.9 10.1 33.6 2.3 ± 0.39
10 18.7 11.2 39.6 2.4 ± 0.03
11 21.0 12.9 45.0 2.3 ± 0.27
12 22.1 14.0 48.1 2.3 ± 0.29
13 8000 16.1 8.1 27.1 1.0 ± 0.02
14 19.0 9.1 40.2 1.2 ± 0.02
15 20.0 9.5 45.0 0.7 ± 0.35
16 22.9 10.3 49.4 1.1 ± 0.04

Los sistemas fueron probados a pH 7, VR cercano a 1 y porcentaje de extracto alimentado de 10% p/p. La pureza fue determinada como se describe en materiales y métodos.
El incremento en la longitud de línea de corte (LLC) parece no tener una marcada influencia sobre la pureza de BPE. Los sistemas fueron construidos a pH 7, al cual la BPE tiene carga neta negativa (pI ˜ 4.2), mientras que el PEG tiene carga positiva, lo cual genera afinidad por la fase superior del sistema. Esto significa que mientras mayor sea la concentración de cargas positivas en la fase superior (mayor concentración de PEG), la afinidad de BPE por la fase superior tambien debe ser mayor. Sin embargo otras proteínas presentes también podrían encontrarse por arriba de su punto isoeléctrico (pI), situación que tambien las hace afines a la fase superior. Si bien la influencia de la LLC no es muy marcada, los 2 sistemas que mayor pureza reportaron (sistemas 4 y 7 en Tabla 1) tienen LLC elevadas, lo cual fue considerado para las etapas experimentales posteriores.
Se realizaron pruebas para estudiar la influencia del pH sobre el comportamiento de partición de BPE en SDFA PEG – fosfato de potasio. Se evaluó el efecto de un incremento del pH del sistema de 7 a 9 sobre la pureza de BPE de la fase superior. Es necesario tomar en cuenta que al aumentar el pH del sistema, un mayor número de proteínas rebasan su punto isoeléctrico (pI), adquiriendo de esta forma una carga neta negativa, lo cual las hace más afines a la fase superior del sistema (Huddleston et al, 1991; Albertsson, et al, 1990). Por lo tanto, aumentar el pH no resultó ser una buena estrategia para aumentar la pureza de BPE y no se observó un beneficio en la pureza de BPE.
Para los estudios de la influencia del VR sobre la pureza de BPE en SDFA, se seleccionaron los sistemas con bajo peso molecular (1000 y 1450 g/gmol) que reportaron las purezas más altas (2.9 y 2.7; ver Tabla 1). Se construyeron 5 sistemas para cada peso molecular a pH 7, 10% p/p extracto BPE y VR variable, y se midió la pureza de BPE (Tabla 2). Es claro observar que un aumento en VR es asociado con un incremento en la pureza de BPE. Esto se podría explicar en función del volumen disponible en la fase superior para captar a la BPE. La BPE muestra una fuerte afinidad por la fase superior. Sin embargo, es posible que debido a la alta carga proteica del extracto, el volumen de la fase superior se sature, impidiendo de esta forma que toda la BPE migre hacia dicha fase debido al impedimento estérico. Por lo tanto es necesario aumentar el volumen disponible para que de esa forma una mayor cantidad de BPE logre migrar hacia la fase superior antes de que ocurra la saturación de la misma. La partición de BPE se ve más favorecida por el aumento del volumen en comparación con la de otros compuestos, y por consiguiente la pureza aumenta. El uso de VR elevado en los SDFA favorece la obtención de una pureza elevada de BPE en la fase superior.

Tabla 2. Influencia del VR sobre la pureza de BPE obtenida en fase superior de SDFA PEG – fosfato de potasio Sistema PEG (g/gmol) LLC (% p/p) VR experimental Pureza BPE (545nm/280nm) I 1000 49.4 2.4 3.1 ± 0.14
II 1.8 2.4 ± 0.07
III 0.9 2.6 ± 0.01
IV 0.4 2.5 ± 0.23
V 0.2 2.2 ± 0.08
VI 1450 53.2 2.4 2.6 ± 0.07
VII 1.8 2.1 ± 0.26
VIII 0.9 1.8 ± 0.03
IX 0.4 1.7 ± 0.03
X 0.2 1.7 ± 0.04
Los sistemas fueron construidos a pH 7 y con una concentración de 10% p/p de extracto.

Es evidente que los parámetros de sistema que favorecen la obtención de una elevada pureza de BPE en la fase superior rica en PEG son: LLC elevado (> 40% p/p), PM PEG bajo (1000 g/gmol, 1450 g/gmol), pH 7 y VR elevado. Si bien se obtiene una pureza relativamente alta de BPE (pureza de 3.1 del sistema I en Tabla 2), el proceso de obtención del extracto de BPE involucra varias etapas relacionadas con la precipitación con sulfato de amonio (centrifugación, adición de sales, disolución, centrifugación, resuspensión). Si bien la precipitación con sulfato de amonio es una técnica bien caracterizada, su implementación a nivel industrial no es muy deseable ya que genera costos indeseados. Con el objetivo de eliminar la etapa de precipitación con sulfato de amonio se probó un método de ruptura celular alternativo a la maceración manual. La precipitación con sulfato de amonio se realizó con la finalidad de concentrar la cantidad de proteína en el extracto, por lo cual es necesaria la implementación de una técnica de ruptura celular alternativa que reporte altos rendimientos de liberación de BPE al medio. Se seleccionó la ruptura por sonicación (que ha sido sustituida con éxito a nivel industrial por ruptura celular mecánica) como candidata para reemplazar a las etapas de maceración manual y la precipitación con sulfato de amonio. Se llevó a cabo ruptura celular mediante los dos métodos de ruptura y se compararon las concentraciones obtenidas de B-ficoeritrina (BPE), así como de otras dos ficobiliproteínas presentes en Porphyridium cruentum, R-ficocianina (RPC) y aloficocianina (APC) (Figura 1).
Considerando que se agregan 4 gramos de agua por cada gramo de biomasa húmeda durante la ruptura, se tiene que por cada gramo de biomasa húmeda se obtienen: 1.1 mg de BPE, 0.6 mg de APC y 0.25 mg de RPC, utilizando sonicación como método de ruptura. Al comparar estos valores con aquellos obtenidos a partir de maceración manual por gramo de biomasa húmeda (0.2 mg de BPE, 0.2 mg de APC y 0.09 mg de RPC) resulta evidente que la ruptura celular por sonicación no solo logra liberar mayor cantidad de BPE por gramo de biomasa húmeda utilizado, sino que además genera un patrón de liberación que favorece a la BPE en comparación de las otras dos ficobiliproteínas presentes.
Figura 1. Comparación de la concentración liberada de BPE ( ), APC ( ) y RPC ( ) al utilizar dos métodos de ruptura celular diferentes. La concentración de biomasa utilizada fue del 25% peso húmedo/volumen. Las concentraciones B-ficoeritrina (BPE), R-ficocianina (RPC) y aloficocianina (APC) fueron estimadas utilizando el sistema de ecuaciones reportado por Bermejo et al, 2002.
Es claro que las concentraciones obtenidas de los tres compuestos mediante sonicación son mucho mayores a aquellas obtenidas mediante maceración manual. En particular la concentración de BPE es 5.5 veces mayor (ver Figura 1). De esta forma, el extracto crudo de BPE se encuentra lo suficientemente concentrado sin la necesidad de llevar a cabo la etapa de precipitación con sulfato de amonio. En lo que respecta a las purezas de BPE obtenidas por cada uno de los métodos de ruptura, no se obtuvieron grandes diferencias al comparar los dos métodos, estando la pureza de BPE entre 0.5 y 0.8, tanto para maceración manual como para sonicación. Debido a los resultados anteriores, se decidió trabajar en las etapas experimentales posteriores con el extracto crudo de BPE obtenido por sonicación.
Una de las características de los SDFA que los hace candidatos ideales para llevar a cabo una integración de procesos (unir dos o mas etapas unitarias en una sola) es que permiten el manejo una gran cantidad de sólidos suspendidos (incluyendo restos celulares). Por lo tanto se decidió utilizar el extracto de BPE sin retirar los restos celulares del mismo, eliminando una etapa de separación sólido-líquido adicional del potencial proceso. Al extracto resultante con fragmentos celulares se le llamo extracto crudo de BPE. Todos los SDFA de las etapas experimentales posteriores se alimentaron con dicho extracto crudo.
A fin de lograr una intensificación del proceso, se decidió probar porcentajes mayores al 10% de extracto crudo de BPE en los sistemas para determinar de qué manera el aumento en dicho porcentaje afecta tanto a la pureza como al porcentaje de recuperación de BPE en la fase superior. Se probaron 4 porcentajes de extracto crudo de BPE (10, 20, 30 y 40% p/p) en un sistema 29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, LLC 45% p/p, VR 4.5 y pH 7. Todos los restos celulares alimentados al sistema a través del extracto crudo de BPE se concentraron en la interfase. Se estimó la pureza de BPE en la fase superior y se calculó el factor de purificación (definido como la relación entre la pureza obtenida en la fase superior del sistema y la pureza en el extracto crudo). Se observó que a medida que aumenta la cantidad de extracto crudo la pureza (y por lo tanto el factor de purificación) de BPE en la fase superior del sistema aumenta (Figura 2).
Al aumentar la carga total de compuestos en el sistema, la BPE, teniendo una mayor afinidad que los otros compuestos presentes, tiende a ocupar los espacios disponibles en la fase superior del sistema, generando impedimento estérico para los compuestos contaminantes presentes en el sistema. La máxima pureza obtenida de BPE (a la concentración del extracto del 40% p/p) fue de aproximadamente 3.2 (Figura 2), similar a la obtenida con el extracto producido mediante maceración manual, remoción de restos celulares y precipitación con sulfato de amonio. Esto significa que la integración (reducción de etapas) del proceso resultó ser benéfica, al permitir obtener una pureza similar a la antes obtenida, con un número considerablemente menor de etapas, lo cual resulta tanto técnica como económicamente beneficioso.
Figura 2. Influencia del porcentaje de extracto crudo sobre la pureza ( ) y el factor de purificación ( ) de BPE. La pureza y factor de purificación reportados fueron obtenidos en la fase superior de sistemas de dos fases acuosas con las siguientes características: 29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, LLC 45% p/p, VR 4.5 y pH 7.
Adicionalmente, resulta evidente que es factible llevar a cabo una intensificación del proceso, al poder manejar altos porcentajes de extracto crudo (40% p/p), lo cual traducido a un contexto industrial representaría poder procesar grandes cantidades de muestra con equipo relativamente pequeño. Con relación a la influencia del porcentaje de extracto crudo sobre el porcentaje de recuperación de BPE en fase superior, en todos los casos estos fueron superiores al 90%. Se observó que cuando el porcentaje de extracto crudo es 10% p/p, el porcentaje de recuperación de BPE obtenido es cercano al 100%. Al aumentar la concentración del extracto en el sistema de 20 a 40% p/p el porcentaje de recuperación de BPE disminuyó a 90%. Considerando tanto la pureza como el porcentaje de recuperación de BPE obtenidos, se puede concluir que el porcentaje de extracto alimentado más conveniente resultó ser 40% p/p, con un porcentaje de recuperación BPE del 90% y una pureza de 3.2.
Figura 3. Influencia de la geometría del sistema (L/D) sobre el porcentaje de recuperación ( ) y el factor de purificación ( ) de BPE en SDFA PEG – fosfato de potasio. Los porcentajes de recuperación y factores de purificación reportados fueron obtenidos en la fase superior de sistemas de dos fases acuosas con las siguientes características: 29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, LLC 45% p/p, VR 4.5, pH 7 y 40% p/p de extracto alimentado.
A fin de visualizar las condiciones para la potencial implementación del proceso de extracción y purificación del colorante BPE a una escala superior, se seleccionaron dispositivos de extracción con diferentes geometrías (relación altura – diámetro, L/D), para determinar el efecto de este factor experimental sobre el porcentaje de recuperación y el factor de purificación de BPE. A medida que aumenta la relación L/D el porcentaje de recuperación de BPE en la fase superior del sistema sufre un ligero decremento, lo cual sugiere que mientras menor es la relación altura – diámetro, mayor el porcentaje de recuperación (Figura 3). Sin embargo, para todas las geometrías estudiadas el porcentaje de recuperación se mantuvo por encima del 90% y el factor de purificación de BPE se mantuvo prácticamente constante. Para facilitar el potencial escalamiento del proceso propuesto, se propuso remplazar la etapa de centrifugación a nivel industrial por sedimentación. Para lo anterior se realizaron pruebas para determinar el tiempo requerido para la formación de las fases. Se varió la geometría de los dispositivos de extracción, para determinar como este factor afecta la velocidad de formación de fases.
Figura 4. Influencia de la geometría del sistema (Relación L/D) sobre el tiempo de formación de fases en SDFA. Se probaron 4 geometrías diferentes: H/D 0.5 ( ), H/D 0.8 ( ), H/D 1.2 ( ) y 2.5 ( ). Los sistemas utilizados tenían las siguientes características: 29% p/p PEG 1000 g/gmol, 9% p/p fosfato de potasio, LLC 45% p/p, VR 4.5, pH 7 y 40% p/p de extracto crudo de BPE.
En la etapa experimental previa se determinó que el aumento de la relación L/D tiene un ligero efecto negativo sobre el porcentaje de recuperación de BPE en la fase superior del sistema. Por lo tanto se trabajaron con relaciones L/D relativamente bajas. La variable respuesta monitoreada en este caso es el VR relativo (VR obtenido por sedimentación/ VR obtenido por centrifugación). Se probaron sistemas de 100 gramos de peso total, con las siguientes características: PM PEG 1000 g/gmol, LLC 45% p/p, VR teórico 4.5, pH 7 y 40% p/p de extracto crudo. Es claro que un valor de la relación altura – diámetro (L/D) bajo, resulta en un menor tiempo de separación de fases (Figura 4). Es posible que el aumento en el área de la interfase disminuya el impedimento estérico en la interfase del sistema, y por lo tanto el flujo de compuestos a través de la misma se ve facilitado. Este comportamiento ha sido reportado previamente para SDFA que procesan suspensiones biológicas diferentes (Solano-Castillo y Rito-Palomares, 2000). Con las geometrías L/D 0.5 y 0.8 se obtuvieron resultados muy similares (Figura 4), por lo cual se anticipa que disminuir la relación L/D por debajo de un valor de 0.5 no representará ningún beneficio significativo en lo que respecta a reducción del tiempo de formación de fases. Se observó que utilizando una geometría L/D de 2.5 se requieren aproximadamente 240 minutos para alcanzar un VR relativo de 0.7 (lo que representa un 70% de la separación de fases). En contraste con un L/D de 0.5 solo se requieren 20 minutos (ver Figura 4). Lo anterior favorece la potencial implementación del proceso a escalas comerciales.
Figura 5. Comparación simplificada entre los protocolos existentes y el proceso propuesto para la recuperación y purificación del colorante natural BPE.
Una comparación directa entre el nuevo proceso desarrollado para la recuperación de un colorante natural de origen microbiano con los protocolos existentes involucrando multi-etapas (ver Figura 5), resalta la superioridad del primero. El proceso propuesto simplifica grandemente el camino mediante el cual colorantes naturales para la industria de alimentos pueden ser recuperados y purificados con una visión práctica de implementación comercial. Es claro que para este tipo de productos, esta estrategia de abre el camino para la futura intensificación de procesos, particularmente para aquellos que su producción usando el proceso convencional no es económicamente factible.

Se logró diseñar un proceso de recuperación primaria y purificación de BPE, utilizando sistemas de dos fases acuosas PEG – Fosfato de potasio como etapa principal. Dicho proceso consta básicamente de dos etapas (ruptura celular mediante sonicación y sistemas de dos fases acuosas). Se logró intensificar el proceso al lograr utilizar concentraciones elevadas de extracto crudo de BPE en los sistemas de dos fases acuosas. Los parámetros de sistema (LLC, PM PEG, pH, VR) influenciaron la partición de la BPE en SDFA y permitieron definir las condiciones bajo las cuales el colorante puede ser recuperado de la fase superior rica en PEG. Los experimentos con sistemas utilizando diferentes geometrías permitieron determinar que el escalamiento del proceso es técnicamente factible, teniendo tiempos de formación y estabilización de fases relativamente cortos al utilizar geometrías L/D menores a 1. El proceso desarrollado permite la recuperación y purificación primaria de BPE, dando como resultado un colorante natural que sobre pasa los requerimientos de pureza que demanda la industria de alimentos.