M. en C. Nestor Gutiérrez Méndez
Dra. Belinda Vallejo-Cordoba
Dra. Guadalupe rginia Nevárez Moorillon
M. en C. Aarón Fernando González-Córdova

E-Mail:
neztorgm@gmail.com, vallejo@cascabel.ciad.mx, aaronglz@cascabel.ciad.mx vnevare@uach.mx

La formación del sabor en el queso, es el resultado de la fermentación de la lactosa y del citrato, así como de la lipólisis y proteolísis (Van Kranenburg et al., 2002). Las bacterias ácido lácticas (BAL) contribuyen de manera decisiva en la transformación bioquímica de la lactosa, del citrato y en el catabolismo de amino ácidos, al ser utilizadas como cultivos iniciadores (Smit et al., 2005). Las BAL se han utilizado como cultivos iniciadores en la elaboración de productos lácteos fermentados (Salama et al., 1993); siendo el genero Lactocccus el mas utilizado en la elaboración de quesos. Los Lactococcus contienen un complejo sistema proteolítico que les permite hidrolizar la caseína, transportar péptidos pequeños dentro de la célula, hidrolizarlos, y finalmente catabolizar los amino ácidos (Law y Haandrikman, 1997). Los amino ácidos son los precursores de importantes compuestos volátiles tales como: aldehídos, cetonas, alcoholes, y compuestos azufrados (Yvon y Rijnen, 2001; Smit et al., 2004; Smit et al., 2005).
El genero Lactococcus se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza (Stark y Sherman, 1935; Corroler et al., 1998) por lo cual es atractivo explorar el potencial de nuevas cepas de Lactococcus ssp. aisladas de diversos nichos, en búsqueda de la biogeneración de aroma en quesos (Ayad et al., 2002). Las BAL han evolucionado tras su adaptación a medios ricos en nutrientes (Bringel y Hubert, 2003), de manera que han perdido cierta capacidad de biosíntesis en comparación con aquellos Lactococcus que han permanecido en sus medios nativos. Esta diferencia, en sus actividades metabólicas, está relacionada con una mayor capacidad en las cepas de Lactococcus aisladas de nichos naturales para producir aroma (Ayad et al., 1999; Ayad et al., 2000; Ayad et al., 2001; Centeno et al., 2002). Sin embargo, es necesario conocer si realmente este tipo de cepas de Lactococcus ssp. aisladas de nichos naturales, tienen la capacidad de biogenerar el aroma característico a queso, aspecto importante a considerar en los cultivos lácticos iniciadores.

En México, existe una gran variedad de quesos tradicionales, los cuales son elaborados a partir de leche cruda, tales como: Chihuahua, Cotija, Fresco, Doble Crema, entre muchos otros. Estos quesos se caracterizan por su sabor y aroma típico, lo cual es muy apreciado por los consumidores. Estos sabores y aromas, son el resultado de la actividad metabólica de la microflora nativa presente. El desarrollo de nuevos CLI para la elaboración de productos lácteos, que tradicionalmente se realizan a partir de leche cruda, representa un reto para la comunidad científica, ya que el lograr que un cultivo asemeje las características sensoriales, tan buscadas, en los productos artesanales, no es tarea fácil. El estudio detallado de las diferencias bioquímicas entre las BAL de los cultivos comerciales y de las aisladas de lácteos artesanales, ó incluso de fuentes vegetales; nos permitirá evaluar de manera objetiva, la viabilidad de emplear nuevas cepas de BAL, biogeneradoras de aroma, en el desarrollo de nuevos CLI. Es importante resaltar, que este tipo de investigación cobra particular importancia, considerando que en México no se comercializan cultivos lácticos iniciadores, que perfilen el sabor y aroma característicos, de los quesos artesanales.

Obtención de Muestras Las muestras de lácteos artesanales fueron obtenidas de queserías artesanales. Las muestras de repollo rojo, repollo blanco, ejote, perejil, brócoli, papa, espinaca, hojas de maíz, mazorcas y betabel, fueron obtenidas del mercado local. Para el caso de los cultivos comerciales, se tomaron muestras de 5 diferentes cultivos liofilizados, ampliamente utilizados en la industria quesera. Además se tomaron muestras de la piel y ubres vacas raza Holstein. Preparación de Muestras Porciones previamente pesadas de las muestras vegetales se licuaron con 99 mL de leche en polvo (10% p/v) estéril y se incubaron a 21 ºC por 48 h. Posterior al periodo de incubación, se realizaron diluciones seriadas con buffer estéril de fosfatos (pH 7.2) y se realizaron siembras por extensión en superficie en placas con agar M17 adicionado con (5% p/v) lactosa (LM17). Las medios inoculados fueron incubados a 21 ºC por 48 h bajo una atmósfera parcialmente saturada de CO2. En las muestras de queso, cuajada y requesón, fue omitido el paso de enriquecimiento, pasando directamente a la realización de diluciones seriadas (Salama et al., 1993). Por otra parte, los cultivos comerciales liofilizados se inocularon en leche estéril al 1% (p/v) y se incubaron a 21 ºC por 12 h. Posteriormente, de la leche fermentada obtenida, se realizaron diluciones seriadas y se inocularon en placas con agar LM17. Finalmente, las muestras de piel y ubre de las vacas se tomaron con hisopo estéril, las cuales fueron resuspendidas en caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) e incubadas a 21 ºC por 24 h. Del caldo de BHI con crecimiento bacteriano se inoculó leche estéril, la fue incubada a 21 ºC por 48 h. De esta leche fermentada se tomaron alícuotas para las diluciones seriadas. Aislamiento de Lactococcus ssp. Del crecimiento obtenido en placas de LM17, se tomaron 20 colonias al azar y se resembraron en medio LM17, para su aislamiento (Corroler et al., 1998). A los cultivos puros se les realizó la prueba de catalasa y tinción de Gram. Los cultivos confirmados como cocos ovoides Gram positivos, catalasa negativos se resuspendieron en caldo BHI (pH 9.6, concentración de 6.5% (p/v) de NaCl) y se incubaron a 45 ºC (7 días) (Salama et al., 1995; Cogan et al., 1997; Corroler et al., 1998). Las cepas de Lactococcus aisladas, se transfirieron a caldo LM17 con glicerol (40% v/v) y se congelaron a -20 ºC hasta su posterior análisis. Caracterización Fenotípica Las cepas identificadas como Lactococcus se resuspendieron en caldo BHI (pH de 9.2, concentración de 4% (p/V) de NaCl) para su crecimiento (Corroler et al., 1998). La capacidad de estas cepas para fermentar glucosa, manitol y salicina utilizando un medio de oxido fermentación y como indicador rojo de fenol, fue evaluada. La capacidad de las cepas para fermentar citrato, fue evaluada utilizando el medio descrito por Kempler y McKay (1980). La velocidad para fermentar la lactosa, así como de hidrolizar la caseína se determinó de acuerdo a lo descrito por Alonso-Calleja et al. (2002) utilizando caldo de enriquecimiento litmus milk. Nariz Electrónica De cada una de las cepas, se tomó una colonia aislada y se transfirió a caldo M17 adicionado al 5% (p/v) con glucosa (GM17), el cual se incubó a 30 ºC por 12-16 h. Posterior a este tiempo de incubación, se tomaron 100 µL del cultivo y se inoculó en 9.9 mL de leche ultrapasteurizada. El número de células viables inoculadas en la leche, se determinó por conteo en placa con agar LM17. De la leche ya inoculada se transfirió 1 mL a un vial estéril (20 mL) y se incubó a 30 ºC por 24 h. Después del periodo de incubación, las muestras se congelaron a -20 ºC hasta su análisis en la nariz electrónica. Este procedimiento se realizó por triplicado para cada una de las cepas de Lactococcus en estudio. Los compuestos constituyentes del espacio de cabeza de las leches fermentadas fueron analizados con una nariz electrónica FOX-3000 (Alpha M.O.S., Francia) provista con automuestreador (HS 100, CTC Analytics), integrada por 12 sensores de oxido de metal (MOS). Antes del análisis de las muestras, estas fueron descongeladas y mantenidas a 4 ºC. Las condiciones del equipo incluyeron un precalentamiento de la muestra a 60 ºC con agitación (500 rpm) por 10 min para favorecer la liberación de compuestos volátiles. Posteriormente, se tomó una alícuota de 2500 µL del espacio de cabeza del vial y se inyectó en la nariz electrónica, a una velocidad de flujo de 150 mL min-1. La respuesta generada por los sensores se colectó por 2 minutos. El análisis de los datos se realizó por análisis de componentes principales (ACP) a partir de una matriz de correlación. Análisis Sensorial Leche ultrapasteurizada previamente inoculada e incubada con cada una de las cepas en estudio, como se describió en el punto anterior, fue utilizada para el análisis sensorial. El olor producido por las leches inoculadas, se evaluó aplicando análisis descriptivo con un panel de 6 jueces entrenados. Dos descriptores sensoriales previamente definidos por los jueces fueron evaluados: aroma a yogurt y a queso Fresco. Este último descriptor fue definido por los jueces como el olor “típico” producido por quesos húmedos y ácidos de leche cruda que presentan un olor intenso posiblemente relacionado con cierto grado de lipólisis o proteólisis. Las muestras fueron evaluadas utilizando una escala no estructurada de 9 cm. Los datos se analizaron por análisis de varianza (ANOVA).