M. en C. Adriana Llorente Bousquets
M. en C. Sandra Pérez Munguía
M. en C. Joaquín Rivera Quiróz
Dra. Amelia Farres González Saravia

E-Mail:
llorente@servidor.unam.mx, permun@servidor.unam.mx, jrquirozmx@yahoo.com.mx, farres@servidor.unam.mx

Los productos cárnicos pueden representar riesgos para la salud por la presencia de patógenos. Se han desarrollado tecnologías que pretenden reducir el procesamiento de los mismos manejando barreras tales como la combinación deliberada de factores intrínsecos (temperatura, Aw, pH, Eh, conservadores, etc.) así como nuevas técnicas de conservación (Caplice y Fitzgerald, 1999), entre las que destacan los procesos biológicos. Tanto las bacterias acidolácticas como sus metabolitos desempeñan un papel importante en este fenómeno y presentan la ventaja de que son reconocidos como ingredientes seguros (GRAS, generally recognized as safe, por sus siglas en inglés) por las entidades regulatorias de alimentos de Estados Unidos, la Unión Europea y nuestro país. Su capacidad de bioconservación se debe a que producen una amplia gama de sustancias con actividad antimicrobiana, entre las que se incluyen ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo, reuterina, bacteriocinas, sustancias inhibitorias similares a las bacteriocinas (BLIS), dipéptidos cíclicos e hidroxiácidos de cadena corta, (Fed. Reg., 1988; Montville y Winkowski 1997; Hugas 1998, Caplice, 1999, Magnusson, 2003).
Existe una gran heterogeneidad de comportamiento entre especies e incluso entre cepas de la misma especie. Por ejemplo se ha reportado que Pediococcus acidilactici es productor de bacteriocinas, específicamente pediocina PA-1 (De Vuyst et al., 1996). No obstante, algunos autores no han encontrado evidencias genéticas de la presencia del gene responsable (Nes y Holo, 2000) en la cepa de este estudio, P. acidilactici ATCC 8042, sin embargo este grupo ha encontrado evidencias de su capacidad bioconservadora, por lo que existe la posibilidad de que produzca sustancias diferentes a bacteriocinas.
Ciertas actividades enzimáticas pueden tener efectos antimicrobianos; se ha acuñado el término de enzibióticos para algunas enzimas bacteriolíticas (Jado et al., 2003). Las bacterias acidolácticas cuentan con sistemas proteolíticos complejos (Pritchard y Coolbear, 1993; Kungi, et al., 1996), si bien en el género Pediococcus no está reportada actividad proteolítica extracelular, sólo actividad intracelular de peptidasas para Pediococcus pentosaceus y de peptidoglicano hidrolasa responsable de la autólisis en bacterias lácticas (Mora, et al., 2003). Aquí se explora la posibilidad de que estas actividades enzimáticas sean las responsables del efecto antimicrobiano en la cepa de estudio.

Particulares

• Caracterizar el fenómeno de la bioconservación de Pediococcus acidilactici 8042 o sus sobrenadantes en un embutido tipo salami.
• Determinar el papel de antimicrobianos tradicionalmente producidos por Pediococcus acidilactici (láctico, pediocina) en el efecto de bioconservación.
• Evaluar in vitro y en salami el daño que produce el cultivo iniciador o sus metabolitos sobre microorganismos de interés sanitario.
• Determinar la presencia de actividad proteolítica en Pediococcus acidilactici ATCC 8042
• Determinar la actividad de peptidoglicano hidrolasa en Pediococcus acidilactici ATCC 8042
• Evaluar el efecto antimicrobiano de las actividades enzimáticas proteolítica y lítica de Pediococcus acidilactici ATCC 8042.
  

Las bacterias acidolácticas producen diversos metabolitos con el potencial de controlar a microorganismos de interés sanitario y microflora presentes naturalmente en los alimentos. El conocimiento de toda la gama de sustancias antimicrobianas producidas puede permitir diseñar estrategias de conservación en alimentos. Se cuenta con un modelo de estudio, la cepa P. acidilactici ATCC 8042, que en pruebas preliminares había demostrado generar una mejor calidad sanitaria en embutidos y para la que en la literatura existe controversia sobre la capacidad de producción de pediocinas. Por tanto, puede explorarse el papel ejercido por otros posibles antibacterianos, incluyendo el de enzimas que han sido reportadas como tales. De ser el caso, este trabajo constituye uno de los primeros reportes de actividad bacteriolítica como agente antimicrobiano en bacterias acidolácticas.

Cepas bacterianas. Pediococcus acidilactici ATCC 8042 del cepario del CINVESTAV, México. Staphylococcus aureus ATCC 6538p del cepario del Posgrado de la FESC-UNAM y Listeria innocua ATCC 33099 del cepario de la UAM-I. P. acidilactici se mantuvo en viales con esferas de vidrio, adicionados de caldo MRS modificado-glicerol (Difco) (Sigma) 80-20% v/v y almacenadas a -20 °C. Las cepas de S. aureus y L. innocua se mantuvieron también en esferas de vidrio adicionadas de caldo nutritivo-glicerol 80-20% v/v almacenadas del mismo modo.
Medios de cultivo. Para el cultivo de P. acidilactici se utilizó caldo MRS (De Man Rogosa and Sharp, 1960) modificado según Llorente (1998). S. aureus y L. innocua se cultivaron en caldo BHI (Difco Laboratories). La caracterización morfológica de las cepas se realizó por observación al microscopio óptico y electrónico.

Condiciones de producción. P. acidilactici se produjo tanto en matraz Fernabach de 3,800 mL, con un volumen de trabajo de 1 L, en un agitador New Brunswick Scientific Co. (New Jersey, USA), como en fermentador instrumentado de 10 L, incubado a 30 ± 2 °C y 120 rpm y se cosechó en fase logarítmica. Los cultivos fueron centrifugados a 10,000 x g durante 30 minutos a 4 °C (Centrífuga Beckman Mod. J2-MC) y se obtuvieron los sobrenadantes, se concentraron por liofilización y se guardaron a -20 °C hasta su uso. La mitad del cultivo se neutralizó con NaOH 50% y la otra no para evaluar el efecto del ácido láctico. Para la evaluación de actividad enzimática, los caldos de fermentación en fase logarítmica se centrifugaron, neutralizaron y concentraron por ultrafiltración (Amicón YM30 con MWCO 30 kDa), se congelaron y liofilizaron.
Modelo alimentario. Se seleccionó un embutido cárnico tipo salami con carne de cerdo y de res (TIF) y S. aureus como microorganismo indicador. Se mantuvieron en una cámara a 25 °C por 24 horas y por 15 días a 10-12 °C y humedad relativa del 70%.

Evaluación de actividad antibacteriana en embutidos. Se elaboraron diez lotes de salami: Los controles sin inocular; controles con células de P. acidilactici a dos niveles (1x10 6 y 1x10 9 UFC/mL); salamis inoculados con 0.42 y 0.84 % de sobrenadantes liofilizados (matraz y fermentador); salamis adicionados con ácido láctico o adicionadas con bacteriocina (Nisaplín? (Aplin and Barret, England)). A las 24 horas de su elaboración, los nueve lotes de embutidos se inocularon con 103 UFC/mL de S. aureus ATCC 6538p en fase logarítmica y el lote 10 (control) sin inóculo de iniciador no se inoculó con S. aureus. A diferentes tiempos se determinaron mesófilos aerobios, BAL y S. aureus en placas PetrifilmTM 3M, según el fabricante y de acuerdo con NOM-109-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994; pH, Eh (potencial redox) y acidez titulable, (AOAC).

Los resultados se analizaron en el Programa Estadístico (SPSS, Chicago IL. 60611, USA), mediante un análisis de varianza (ANOVA), en el cual se incluyó la comparación múltiple de medias de Duncan (p < 0.05 y 0.01).

Identificación del efecto antibacteriano producido por los sobrenadantes de cultivo de P. acidilactici sobre las células de S. aureus y L. innocua.
Se evaluó la actividad antibacteriana de los sobrenadantes por difusión en agar y por cuenta de colonias con medio BHI, con S. aureus y L. innocua como microorganismos susceptibles. El daño se comparó con células cultivadas en medio BHI (control) (NCCLS, 1991 y Ray y Hoover, 1993). Para observarse al microscopio electrónico las células se fijaron con glutaraldehído al 4% w/v, se lavaron con buffer de fosfatos de sodio 0.2 M pH 7.3 (Na2HPO4 y NaH2PO4 .7 H2O, Ted Pella Inc. Reactivo ACS) y en post-fijación adicional se trataron con tetraóxido de osmio al 4% w/v y se lavaron. Se deshidrataron con soluciones de etanol 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% y se secaron a 0 °C en atmósfera de CO2 (Secador Marca Emitech Mod. K850). Se cubrieron con oro (Evaporador con placa de oro paladio Marca Emitech Mod. K550) y se observaron al microscopio electrónico de barrido (MEB) (Marca Hitachi S 2460-N).
Caracterización de la sustancia responsable del efecto antibacteriano.
Identificación de la presencia del gene de la pediocina. Se extrajo el ADN (Anderson y McKay, 1983 y Sambrok, et al., 1989). Se amplificó ADN genómico y plasmídico por PCR empleando los primers específicos del gene PapA del operón de la pediocina reportados por Martínez, et al., 1998.

Determinación de proteínas. Se usó el kit Protein Assay (Bio-Rad) con Albúmina Sérica Bovina como estándar.

Determinación de la actividad proteolítica. Se prepararon dispersiones de tres diferentes sustratos. azocaseina (Sulfamide-azocasein R.A. Sigma) para evaluar actividad caseinolítica (Charney y Tomarelli, 1947), hide powder azure (HPA) para colagenasa, (Rinderknecht, et al., 1968) y elastin-Congo red (Sigma) para elastasa (Kessler, et al., 1993). La coloración de los sobrenadantes obligó a considerar la utilización del propio medio sometido a ebullición como blanco adicional.

Zimografías SDS-PAGE renaturalizantes. Actividad proteolítica. Se realizó SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes (Laemmli, 1970) y las técnicas zimográficas para la detección de proteasas microbianas de Lantz y Ciborowski, 1994. Se hicieron en paralelo la identificación del perfil de proteínas y zimografías en geles de 6, 7.5 y 12.5% de poliacrilamida o copolimerizada con 0.1% gelatina (Wu y Wong, 1984). Se utilizó como control de actividad tripsina (1?g de proteína por carril). La electroforesis se realizó a 100 V constante, durante 1.5 h en una cámara Mini-Protean III (Bio-Rad). Los geles se lavaron con una solución de Tritón–X-100 al 2.5% w/v durante 1 h, los de gelatina se renaturalizaron durante 4 h en buffer Tris-HCl 0.05 M pH 7.5, CaCl2 0.005 M, NaCl 0.2M, Tritón al 2.5% w/v. Para detectar la actividad caseinolítica se incubaron los geles en una dispersión de caseína al 2% en el buffer mencionado antes a 37 °C durante 14h (García-Carreño, 1993). Se incluyeron estándares de peso molecular (High Range y Broad Range, Bio-Rad, Ca, USA), en los geles con o sin sustrato respectivamente (Martínez-Moya et al., 2002). Los geles se tiñeron con una solución de Azul Brillante de Coomassie 0.1% en Metanol:Ácido Acético:Agua Destilada (40:10:50) y se destiñeron con esta misma solución.
Identificación de la actividad lítica. La actividad lítica extracelular fue identificada utilizando los protocolos de Leclerc y Asselin, 1989, y Mora, et al., 2003. Se hicieron geles SDS-PAGE al 6, 7.5 y 12.5% de poliacrilamida adicionados del 0.2% de los siguientes microorganismos Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 (Sigma), S. aureus ATCC 6538p como sustratos para demostrar la actividad de peptidoglicano hidrolasa. Tras la electroforesis se hicieron dos lavados en agua desionizada en agitación suave durante 30 min cada uno y posteriormente se incubaron en el buffer de renaturalización (Tris-HCl 25 mM l-1 pH 8 con Tritón al 1% durante 6-40 h. Posteriormente se tiñeron durante 30 min con azul de metileno (Sigma) al 1% w/v en KOH al 0.1% w/v y se destiñeron con agua destilada. Las imágenes de los geles fueron analizadas para el cálculo de los pesos moleculares relativos con un Imaging Densitometer GS-700 y el software Quantity One 4.2.1 (Bio-Rad Ca, USA).

Inhibición de la actividad proteolítica por tratamiento con inhibidores de proteasas. Se buscó inhibir la actividad proteolítica y lítica de los sobrenadantes con diferentes inhibidores de proteasas: Complete EDTA Free (inhibidor de serín y cisteínproteasas), PMSF (phenyl methyl sulphonyl fluorhide, inhibidor de serínproteasas) y EDTA (Ácido Etilendiaminotetracético, inhibidor de metaloproteasas). Se adicionaron al buffer de renaturalización en una concentración 10 mM, según instrucciones del fabricante.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Los productos cárnicos pueden ser contaminados durante el procesamiento por diferentes microorganismos. Uno de ellos es S. aureus, patógeno y principal responsable de las toxiinfecciones de origen alimentario (Le Loir, et al., 2003), que además ha sido recomendado como indicador por el NCCLS (1991), por lo que se seleccionó como microorganismo de prueba. Por otra parte, en la industria alimentaria existe gran preocupación por la posibilidad de contaminación con Listeria monocytogenes, por lo que se empleó como microorganismo de prueba Listeria innocua ATCC 33099, por su relación filogenética y su susceptibilidad a bacteriocinas..

La primera etapa del trabajo consistió en verificar el efecto de bioconservación de la cepa o sus sobrenadantes. Se realizó un diseño experimental para evaluar el efecto de cultivos de P. acidilactici (a dos niveles), de sus sobrenadantes obtenidos en diversas condiciones (a dos niveles), del ácido láctico y de bacteriocinas comerciales sobre la calidad de embutidos sujetos a fermentación. Se emplearon lotes inoculados con S. aureus para evaluar el efecto sobre este microorganismo de prueba, además del ejercido sobre la microflora nativa. Los resultados mostrados en la fig. 1 permiten observar diferencias de aspecto entre los diversos lotes a 24 h y 96 h de fermentación.

Figura 1. A la izquierda se presentan los salamis de diferentes lotes, tras 24 h de elaboración. A la derecha los salamis después de 96 h de fermentación.

Estas se explican por los resultados obtenidos en la caracterización microbiológica de los productos, de las que se presentan algunos ejemplos en la fig. 2.

Figura 2. Evolución de mesófilos aerobios, bacterias ácidos lácticas, S. aureus y pH en salamis control, respecto de los inoculados con cepa iniciadora o adicionados de sobrenadantes de cultivo.

Los resultados más importantes son: en los lotes control, sin iniciador, los mesófilos se incrementaron en 4 log y las BAL en 5 log, S. aureus creció 1.3 log y alcanzaron un pH de 5.67 en 4 días. En tanto, en los lotes inoculados con P. acidilactici se logró una disminución en la población de mesófilos aerobios de 1-1.5 log y las bacterias acidolácticas adicionadas predominan sobre las propias del salami. También se logró una reducción de 1–1.8 log de S. aureus tras el reto con 3 log de ese microorganismo. Aunque el efecto podría deberse al drástico descenso del pH en 24 h, no hay mayores diferencias en este parámetro entre los diferentes lotes.
Los resultados permiten demostrar el efecto de bioconservación por la cepa, y el hecho de que se haya obtenido el mejor resultado al emplear la cepa directamente puede indicar un efecto sinergístico entre varios de sus metabolitos. La diferencia de respuesta entre los sobrenadantes obtenidos de matraz y fermentador indica que se producen sustancias distintas de acuerdo a las condiciones de cultivo.
Con el fin de descartar el efecto del ácido láctico se procedió a evaluar el efecto antibacteriano de los sobrenadantes de cultivo neutralizados. Los resultados de pruebas de actividad antibacteriana de difusión en agar empleando S. aureus fueron de 32 mm de diámetro para el sobrenadante concentrado diez veces por liofilización, de 24 mm para el sobrenadante que además se neutralizó y de 30 mm para el control que consistió en utilizar una solución de Nisaplín ?(10 mg mL-1), en este último L. innocua evidenció un halo de inhibición de 30 mm con respecto del de 42 mm que presentó el tratamiento con sobrenadante neutralizado y liofilizado.

Figura 3. Actividad antibacteriana evaluada porpruebas de difusión en agar. En la parte superior S. aureus 1) sobrenadante liofilizado, halo de 32 mm de diámetro; 2) sobrenadante neutralizado y liofilizado, halo de 24 mm; 3) nisaplín 10 mg mL-1 . En la parte inferior L. innocua 4) sobrenadante neutralizado y liofilizado halo de 42 mm; 5) nisaplín 10 mg mL-1 halo de 30 mm

Además de los cambios morfológicos y coloniales de las células de S. aureus tratadas se observaron cambios en la tinción de Gram: en lugar de Gram positivas se observaban como Gram negativas (de color rojo) al microscopio óptico, lo que podía sugerir un daño en la pared de las células. El efecto contundente observado en L. innocua llevaba a pensar además de que P. acidilactici producía bacteriocinas (pediocinas), características por su actividad contra este microorganismo.

Al evaluar actividad antimicrobiana por reducción de cuenta en placa se encontró correlación con los datos anteriores, ya que no crecieron las células tratadas con los sobrenadantes neutralizados y liofilizados después de 24 h de incubación, y en contraste las células control cultivadas en medio BHI a 37 °C alcanzaron niveles de crecimiento de 8 y 9 UFC mL-1 de S. aureus y l. innocua, respectivamente.

Las células de los microorganismos de prueba tratadas y control se observaron al MEB y sólo se encontraron detritus celulares (Figura 4) y se distingue el tipo de daño en las células tratadas con respecto de las células control. En virtud de la similitud de los resultados obtenidos con sobrenadantes y con el uso de bacteriocina (Nisaplín), se supuso que una sustancia de este tipo era la responsable de este daño celular.

Figura 4 Fotografías de microscopio electrónico de barrido que muestran las células de
1) S. aureus y 4) Listeria innocua en BHI (control)
2) S. aureus y 5) Listeria innocua tratadas con sobrenadante neutralizado y concentrado
3) S. aureus y 6) Listeria innocua tratadas con una solución de nisaplín 10 mg mL-1

Identificación de la presencia del gene de la pediocina. En virtud de que las bacteriocinas reportadas para este género son las pediocinas, se buscó la presencia del gene de la pediocina PA-1 por amplificación por PCR del gene papA del operón de correspondiente (Martínez, 1998). Se esperaba un producto de 713 pb, que no se obtuvo tras evaluar varias condiciones de amplificación de ADN genómico ni plasmídico. Cabe agregar que el plásmido detectado en esta cepa es mucho menor al reportado para otras de la misma especia que codifican para pediocinas (datos no mostrados). La ausencia del gene explica lo reportado por Mora et al., 2000, quienes afirman que la cepa ATCC 8042 no es bacteriocinogénica, por lo que el efecto debe ser ejercido por sustancias de naturaleza distintas a las reportadas y se exploró a continuación la posibilidad de que éstas fueran actividades bacteriolíticas.

Determinación de actividad proteolítica Buist et al., 1998, han encontrado que la autólisis de L. lactis está influenciada por proteólisis o por degradación de la proteinasa (caseinasa), aunque otras cepas muestran actividad sobre otros sustratos, como el caso de la lisostafina de Staphylococcus simulans, que posee actividad gelatinolítica y elastolítica (Park et al., 1995). Se procedió a evaluar la actividad sobre dispersiones con diferentes sustratos proteínicos (azocaseína, elastina, colágeno).

Tras evaluar diferentes tiempos, pH y temperaturas de reacción el único caso en el que se detectó actividad en dispersión fue sobre la elastina. En virtud de que e la actividad caseinolítica no fue detectada en dispersiones de azocaseína, ni en geles de poliacrilamida copolimerizados con caseína, fue necesario renaturalizar el gel de proteínas y después incubarlo durante 14 h en una dispersión de caseína al 2% para evidenciar la banda de actividad > 200 kDa (figura 7)

Debido a que la tripsina (0.1 -10 µg) no hidrolizó a la elastina, por lo que se utilizó el sobrenadante de cultivo de P. acidilactici para montar el método, monitoreando la evolución de la actividad a diferentes tiempos de reacción.

El sobrenadante de cultivo de P. acidilactici neutralizado y concentrado por ultrafiltración y liofilización fue capaz de reconocer e hidrolizar a la elastina y se generó un incremento de absorbancia de 0.004 UA/ h mL, lo que equivale a 0.002 UA/ h µg proteína (figura 5).

Figura 5. Evaluación de la actividad proteolítica del sobrenadante de cultivo de P. acidilactici concentrado por ultrafiltración y por liofilización. La reacción se realizó con una dispersión de elastina de 5 mg mL –1 pH 8.5, 800 rpm, 37 °C.. A (absorbancia). Una unidad de actividad Elastasa se define como la cantidad de enzima que produce un incremento de absorbancia A495 nm de 1 unidad/hora

Zimogramas Con el objeto de identificar la proteína responsable de esta actividad se llevaron a cabo zimogramas bajo condiciones desnaturalizantes (Martínez-Moya et al., 2002). Se detectó una banda de hidrólisis > 200 kDa con caseína y gelatina y además una de alrededor de 70-80 kDa con gelatina, lo que indica la presencia de más de una proteasa extracelular. La actividad hidrolítica sobre gelatina puede estar asociada a la actividad que en dispersión fue capaz de solubilizar a la elastina.

La actividad proteolítica se detectó en presencia de CaCl2 en el buffer de renaturalización, lo que sugería la presencia de metaloproteasas, aunque al adicionar EDTA 10 mM al buffer de renaturalización la actividad proteolítica no se inhibió y se observaron las mismas bandas de actividad detectadas en los geles con gelatina o caseína sin EDTA. Simitsopoulou, et al., 1997 reportan que Pediococcus pentosaceus posee una tripeptidasa intracelular cuya actividad se incrementa con Ca2+ y es fuertemente inhibida por ditiotreitol (DTT) y ?-mercaptoetanol. La actividad proteolítica extracelular encontrada en P. acidilactici aún después de estar en un ambiente reductor (ß-mercaptoetanol o DTT) y con la adición de urea, CHAPS, SDS y EDTA, fue capaz de renaturalizarse en presencia de Tritón (2.5 % en buffer, pH 8.0). Sin embargo, esta actividad se pierde tras calentar la muestra (90 °C durante 5 min.). Al observarse un perfil electroforético similar con y sin agente reductor, aun tras la adición de urea y CHAPS para facilitar su solubilidad y con tratamiento térmico de la muestra, se presume que ambas formas correspondan a su forma monomérica y madura (figura 6).

Figura 6 Perfil electroforético en SDS_PAGE 7% de sobrenadante concentrado por ultrafiltración. Fue necesario concentrar la muestra mediante precipitación con ácido tricloroacético. La concentración de proteína fue de 0.86 ug proteina/carril.

La banda de actividad en gelatina (80 kDa) es mas activa que la tripsina en términos de intensidad relativa a concentración de proteína.

La actividad caseinolítica no fue detectada en dispersiones de azocaseína, ni en geles de poliacrilamida copolimerizados con caseína; sin embargo, cuando se renaturalizaron las proteínas inmeras en el gel y se incubaron durante 14 h en una dispersión de caseína al 2% fue posible evidenciar la banda de actividad > 200 kDa (figura 7)

Figura 7 Zimogramas a) poliacrilamida 7.5%-gelatina 0.1%, b) poliacrilamida 7.5%-caseína 2%, c) MPM BR (amplio rango) (Bio-Rad)

Zimogramas de actividad lítica. Los microorganismos emplean actividades enzimáticas para lisar a otros como una respuesta de defensa. Una de las mas conocidas es la autolítica, que resulta de hidrólisis del peptidoglicano de la pared celular, por peptidoglicano hidrolasas endógenas, también denominadas autolisinas. Mora et al., (2003) reportan la presencia de actividad autolítica intracelular en P. acidilactici y P. pentosaceus, en tanto Cibik y Chapot Chartier, 2000 la han encontrado en Leuconostoc mesenteroides, Buist et al., 1998, en Lactococcus lactis, en fase estacionaria.

Se procedió a evaluar la actividad lítica en el sobrenadante, que, como se ha dicho antes, provenía de cultivo en fase logarítmica. En los geles de poliacrilamida al 7..5% copolimerizados con Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 como sustrato (figuras 8 y 9), se encontró una banda de actividad lítica de 110 kDa después de 6 h en buffer de renaturalización, al igual que en los geles de S. aureus ATCC 6538p, en estos últimos se requirieron 18 h de incubación en el buffer de renaturalización.

Las bandas de actividad lítica con un peso molecular relativo igual en geles copolimerizados con diferentes microorganismos obtenidas a diferentes tiempos de renaturalización sugieren diferencias de afinidad por el sustrato. Kessler en 1993 reportó una endopeptidasa estafilolítica de Pseudomonas aeruginosa altamente bacteriolítica, que hidroliza ambas uniones peptídicas específicas D-Ala-Gly/Ala entre la subunidad del péptido y el interpéptido y la unión Gly-Gly en el puente interpéptido. Una banda con este mismo peso molecular fue capaz de hidrolizar a la elastina.

Figura 8 Zimogramas de actividad lítica poliacrilamida 7.5% copolimerizada con 0.2% de células de Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 (Sigma), (6 h en buffer de renaturalización); sobrenadantes de cultivo de P. acidilactici ATCC 8042 concentrado con Amicón MWCO 30 kDa 1) actividad lítica de aprox. 110 kDa; 2) la señal lítica disminuye al adicionar EDTA 1 mM; 3) la señal lítica desaparece con EDTA 10 mM; 4) MPM BR ( amplio rango) (Bio-Rad).

Figura 10 Zimogramas de actividad lítica poliacrilamida 7.5% copolimerizada con 0.2% de células de S. aureus ATCC 6538p, (18 h en buffer de renaturalización); sobrenadantes de cultivo de P. acidilactici ATCC 8042 concentrado con Amicón MWCO 30 kDa 1) actividad lítica de aprox. 110 kDa; 2) sin señal lítica al adicionar EDTA 10 mM; 3) MPM BR (amplio rango) (Bio-Rad).

CONCLUSIONES

1. Pediococcus acidilactici ATCC 8042 y sus sobrenadantes de cultivo neutralizados, ejercen un efecto de bioconservación en embutidos cárnicos.
2. La cepa produce una actividad antibacteriana extracelular, no codificada por el gene de pediocina, que no fue encontrado en la cepa.
3. En el medio extracelular se encontró actividad proteolítica, activa sobre elastina en dispersión, que corresponde a una banda de una banda de actividad >200 kDa en geles de caseína y de 80 kDa en gelatina, lo que indica que la actividad detectada corresponde al menos a dos proteínas diferentes.
4. En el medio extracelular se encontró también actividad lítica, que se demostró en zimogramas de M. lysodeikticus, S. aureus,
5. Se presume que las actividades proteolítica y lítica extracelulares encontradas en los sobrenadantes de cultivo de 8 h de Pediococcus acidilactici ATCC 8042 son las responsables de la actividad antibacteriana observada al utilizar como microorganismos susceptibles a Micrococcus lysodeikticus y S. aureus.

IMPORTANCIA DE LOS NUEVOS HALLAZGOS Y SUS APLICACIONES

El desarrollo de nuevos sistemas de conservación, en particular de tipo biológico, asociado al concepto de natural, es una demanda de los consumidores a nivel mundial. El mayor conocimiento de las bacterias ácido lácticas, tradicionalmente empleadas con este fin, permite diseñar nuevas alternativas.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que a la lista de agentes antimicrobianos generados por este grupo de bacterias, y en particular, de Pediococcus acidilactici, hay que añadir a las actividades enzimáticas señaladas, proteasas y peptidoglicanhidrolasa en este caso, como moléculas responsables, al menos parcialmente, de fenómenos de bioconservación. El hallazgo resulta interesante porque ambas enzimas, provenientes de otras cepas, han sido empleadas ya en industria láctea, particularmente para acelerar la maduración de quesos, lo que puede asegurar su inocuidad Esto facilitaría su aplicación, a diferencia de la controversia regulatoria que ha generado la introducción al mercado de bacteriocinas.

Este trabajo constituye uno de los primeros reportes de actividad enzimática como agente antimicrobiano en bacterias acidolácticas.

AGRADECIMIENTOS

Proyecto CONACyT 95328-B, Proyectos PAPIIT-DGAPA-UNAM IN209100e IN230103. Adriana Llorente y Joaquín Rivera recibieron beca CONACYT y apoyo PASPA-DGAPA-UNAM, Cátedra de Tecnología de Productos Cárnicos FESC-UNAM
Berenit Mendoza, del Instituto de Biología de la UNAM, por el apoyo en la obtención de las imágenes de Microscopía Electrónica.

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