Entre los frutales de clima templado, el manzano ocupa en México el primer lugar en superficie con más de 67,000 ha, aportando cerca del 1 % de la producción mundial (FAO, 2003). En las zonas altas del centro del país, este frutal puede prosperar bajo temporal, tal como ocurre en los municipios de San Joaquín y Cadereyta, en el estado de Querétaro. Entre los problemas que limitan la producción de manzana en la región podemos mencionar su baja calidad y deficiente comercialización debida, en parte, al intermediarismo y a la falta de conocimiento en lo que se refiere al almacenamiento en frío convencional, lo que permitiría al productor obtener mejores precios por su manzana al disponer de un mayor lapso de tiempo para comercializarla.
Durante el almacenamiento del producto se presentan pérdidas que tienen su origen principalmente en daños producidos por hongos (se estiman en más del 25 % del total de la producción en los países desarrollados). De éstas, más de 80 % son atribuidas a la pudrición azul ocasionada por Penicillium expansum Link (Spotts et al., 1999) que es capaz de desarrollar por debajo de 0° C (Snowdon, 1990). Los frutos atacados manifiestan un olor a humedad y pueden contraerse y momificarse en condiciones secas, mientras que, en condiciones húmedas, las zonas de lesión se reducen a una masa blanda y húmeda. Las esporas pueden llegar a sobrevivir durante largas temporadas sobre los contenedores, especialmente si éstos son de madera, donde el hongo puede crecer y reproducirse.
Existen diversos métodos para controlar las pudriciones en poscosecha, destacando el uso de fungicidas, práctica no muy aceptada en la actualidad debido a la toxicidad de los productos y a la posibilidad de aparición de razas fisiológicas del hongo resistentes a estos productos. Una alternativa es la utilización de levaduras, microorganismos capaces de desarrollar a bajas temperaturas por tiempos prolongados (Usall et al., 2001). A nivel mundial se ha realizado un gran número de estudios tendientes a detectar cepas de levaduras nativas con capacidad antagónica contra enfermedades de poscosecha. La metodología básica para ello consiste en la inoculación de la levadura y el hongo sobre manzanas heridas y la medición del desarrollo del hongo después de un tiempo determinado de incubación del fruto (Usall et al., 2000). En la actualidad existen preparaciones comerciales de bacterias y levaduras antagónicas que han dado muy buenos resultados en el control de la pudrición azul (ñas et al., 2001). Desgraciadamente, el elevado costo de la importación del producto y la inconsistente respuesta que se ha observado cuando éstos son probados en regiones distintas a las de su origen, han dificultado su uso universal.

Objetivos específicos

1. Purificar y almacenar distintas cepas de levaduras presentes en la superficie de manzanas producidas en distintas comunidades de la Sierra de Querétaro
2. Evaluar la capacidad antagónica de cepas de levaduras contra el hongo Penicillium expansum mediante bioensayos in vitro
3. Evaluar el efecto antagónico de cepas de levaduras contra P. expansum sobre manzanas ‘Golden Delicious’
4. Estudiar la correlación entre el efecto antagónico de las levaduras obtenido en medio de cultivo y el obtenido sobre frutos
5. Identificar a nivel de especie las cepas de levadura que manifestaron el mayor efecto antagónico sobre P. expansum en frutos

En la actualidad la comercialización de la manzana es deficiente, lo que obliga a almacenar el producto en busca de mejores precios. Sin embargo, se tienen importantes pérdidas en poscosecha debido al manejo deficiente del producto.
La obtención de microorganismos capaces de inhibir el crecimiento de hongos patógenos de poscosecha como P. expansum en manzana permitirá sustituir el uso de compuestos químicos utilizados actualmente para el control de enfermedades en frutos almacenados que causan toxicidad y que con el tiempo producen cepas resistentes a estos productos. Las levaduras son microorganismos con gran capacidad de adaptación a las temperaturas bajas, temperaturas a las que la manzana se almacena, además, su alta estabilidad genética y su ya evaluada capacidad antagónica contra hongos de poscosecha facilita la búsqueda de estos microorganismos.
La obtención de cepas de levadura con capacidad antagónica permitirá la elaboración de un producto comercial natural para el control de enfermedades de poscosecha.

Metodología

I. Material Biológico
1. Fruta. Muestras de manzana de diferentes cultivares de huertos comerciales de Cadereyta y San Joaquín (Querétaro, México) y, muestras de manzana de cultivares experimentales establecidos en el INIFAP, fueron utilizadas para el aislamiento de cepas de levaduras. Además, muestras del cultivar ‘Golden Delicious’ de Cadereyta y de EE.UU. (Prueba confirmatoria), fueron utilizadas para evaluar la capacidad antagónica de las levaduras recuperadas. Las muestras fueron rotuladas, colocadas en cajas con ventilación y almacenadas a 1 a 2° C y 90 a 95 % de humedad relativa (HR), hasta su utilización.
2. Hongo. Se utilizó una cepa del hongo ‘Penicillium expansum Link’ recuperada de manzanas ‘Golden Delicious’ en pudrición, siendo seleccionada por haber manifestado la mayor virulencia en manzanas almacenadas cuando se comparó con otras cepas recuperadas. La cepa fue registrada en 2003 con la clave: CFNL2016 (*), y se almacenó en medio de agar papa-dextrosa (APD) efectuando resiembras e inoculaciones sobre frutos para mantener la virulencia. Los inóculos se obtuvieron por recuento de conidios viables por la técnica de vaciado en placa en medio NYDA. Con el recuento, se calculó la dilución para obtener la concentración requerida (French y Hebert, 1980; ñas et al., 1998).
3. Levaduras. Se utilizaron cepas de levadura recuperadas de las manzanas colectadas y de velos de vinos producidos en el laboratorio de fisiología de poscosecha de la UAQ. Las colonias se seleccionaron con base en morfología colonial contrastada.

II. Aislamiento, purificación y almacenamiento de las levaduras
De cada muestra de manzana se tomaron 10 frutos almacenados en refrigeración; éstos se colocaron cada uno en una bolsa de plástico conteniendo 80 ml de diluyente de peptona estéril. La superficie del fruto se frotó desde afuera de la bolsa durante 2 min. La suspensión se sembró en medio APD adicionado con Rosa de Bengala al 0.6 % y solución de ampicilina y se incubó a 26° ± 1° C, de tres a cinco días (Fernández, 1981). Las levaduras fueron purificadas por siembras en agar nutritivo dextrosa para levaduras (NYDA: 8 g de caldo nutritivo, 5 g de extracto de levadura, 10 g de dextrosa, 20 g de agar y 1000 ml de agua), adicionado de solución de ampicilina (100 mcg/ml de medio), de acuerdo con French y Hebert (1980). Los cultivos puros fueron transferidos a tubos conteniendo NYDA inclinado, e incubados (26° ± 1° C / 48 h). Una vez obtenido el crecimiento, se colocó aceite mineral estéril sobre el cultivo y los tubos fueron almacenados a 1° C, hasta su utilización. Las suspensiones de las levaduras fueron obtenidas de crecimientos en caldo nutritivo dextrosa para levaduras (NYDB: NYDA sin agar) durante 48 - 72 h a 26 ± 1° C y 200 rpm de agitación. El medio NYDB fue centrifugado a 10,000 rpm por 10 min. Las células fueron resuspendidas en agua desionizada estéril. Diluciones decimales fueron realizadas a partir del concentrado y 0.1 ml de cada dilución fue sembrado por extensión por superficie en NYDA a 26° ± 1° C para determinar el número de células viables (Teixidó et al., 1998a; ñas et al., 1998).

III. Bioensayos in vitro
Se colocó 1 ml de una concentración de 1 x 107 UFC/ml de la levadura a evaluar en cajas de Petri 60 x 10 estériles; éste fue adicionado de 8 ml de NYDA temperado a 45° C, el medio se homogeneizó y se dejó solidificar. Placas de NYDA exentas de la levadura fueron utilizadas como testigos. Posteriormente se inocularon 5 µL de una suspensión de 1 x 104 UFC/ml de P. expansum en cada uno de tres puntos equidistantes de la placa. Las placas fueron incubadas a 26° ± 1° C, y los diámetros de crecimiento del hongo en presencia de la levadura fueron medidos después de 48, 72, 96, 120 y 144 h de incubación, la prueba fue repetida tres veces (Lawrence y Wilson, 1984; Teixidó et al., 1984; Burr et al., 1996). Se probaron 39 cepas de las levaduras recuperadas de las manzanas. El diseño experimental fue un completamente al azar, con tres repeticiones, siendo la unidad experimental una caja de Petri.

IV. Bioensayos en frutos
1. Inoculación de los frutos. Las muestras de manzana del cultivar ‘Golden Delicious’ provenientes de Cadereyta y que se encontraban en almacenamiento fueron desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio a 1.5 %, durante 30 seg. y se dejaron secar bajo campana de flujo laminar por 10 min. Posteriormente, en cada fruto se realizaron tres perforaciones (3 x 3 mm y 3 mm de profundidad) en el epicarpio con un escalpelo de acero inoxidable estéril. Las perforaciones fueron realizadas en sitios equidistantes de la zona ecuatorial de la manzana. En las heridas se depositaron 25 µL de la suspensión celular de la levadura o de agua destilada estéril para el caso del testigo (ausencia de levadura). La suspensión se dejó secar nuevamente bajo la campana de flujo laminar. Posteriormente, 20 µL de la suspensión del hongo fue inoculada dentro de las perforaciones de los frutos y éstos fueron colocados en frascos de plástico desinfectados con etanol a 70 %, los frascos se incubaron a 26° ± 1° C, el diámetro de la lesión fue determinado después de cuatro, ocho y 12 días de incubación (Ippolitó et al., 2000; Nunes et al., 2001; Usall et al., 2001, González, 1999; Teixidó et al., 1998b). Se evaluaron 104 cepas de las levaduras recuperadas. El diseño del experimento fue un completamente al azar con cinco repeticiones, siendo la unidad experimental una manzana. Para evaluar la totalidad de las levaduras hubo necesidad de realizar nueve ensayos (grupos) con distinto número de cepas de levaduras y un testigo por ensayo.

V. Análisis de los datos
Se aplicó el análisis de varianza de Fisher y la prueba de medias de Tukey para cada tiempo de incubación (in vitro y sobre fruto) y considerando dichos tiempos como repeticiones. Se utilizó el programa estadístico de computadora ‘JMP’ para Windows 98 (Castaño y Domínguez, 2001).

VI. Análisis de correlación
Se llevó a cabo un análisis de correlación simple entre los resultados obtenidos en el bioensayo ‘in vitro’, y los resultados obtenidos en los experimentos sobre fruto, además se adicionó como factor a la velocidad de crecimiento de las levaduras a 72 horas de incubación en medio NYDB, utilizando el programa estadístico para computadora ‘JMP 4’ para Windows 98.

VII. Identificación de las cepas de levadura sobresalientes
Las mejores cepas de levadura fueron identificadas a través del sistema Biolog® que utiliza una base de datos para levaduras (Biolog Microstation Mod NE 10137’, Molecular Devices con el Software ‘MicroLog 3). Colonias de las levaduras de tres resiembras de 48 hrs a 26° ± 1° C en NYDA se removieron del agar con un hisopo estéril, y se transfirieron a un tubo con 18 ml de solución salina estéril (NaCl a 0.85%). La turbidez del tubo se ajustó a 47 ± 2 % de Transmitancia (T) a 590 nm en un espectrofotómetro Mod 7550 UV-s (Mel de México S.A. de C.V.) con ajuste previo a 100% T con solución salina. Cada uno de los 96 pozos de la microplaca YT fue inoculado con 100 µL de la suspensión de levaduras. Una vez realizada la inoculación, la placa fue cubierta e incubada por 72 h a 26 ± 1° C. Un ambiente húmedo se generó colocando toallas húmedas en la parte inferior de las microplacas (BIOLOG, 2001). Las cepas que no pudieron ser identificadas por el sistema fueron reconocidas a nivel de género con la ayuda de manuales de identificación y con la ayuda de expertos (Malloch, 1981; Barnett y Hunter, 1972; Castillo, com. Pers.).

Resultados y discusión

I. Cepas de levaduras recuperadas
Un total de 140 cepas de levaduras nativas fueron recuperadas de las muestras de manzanas colectadas. Por otra parte, se obtuvieron tres cepas recuperadas de cultivares de manzana como ‘India A’ (1) e ‘India B’ (2) establecidas en CENGUA, INIFAP, y dos cepas fueron recuperadas de vinos en almacenamiento elaborados en el laboratorio, una de ellas de un vino blanco y la otra de un vino tinto.

II. Bioensayos in vitro
En la Tabla 1 se puede observar que más de 97 % de las cepas probadas propiciaron, a los primeros días de incubación, una inhibición significativa del crecimiento del hongo (p ? 0.05). Después de 48 h de incubación, la levadura ’16 212’ propició el más pobre crecimiento diametral del hongo (3.48 mm contra 8.27 mm del testigo). Lo anterior corresponde a una inhibición de 57.9 % del crecimiento diametral, pero a 83 % del crecimiento del hongo en unidad de área. Otras cepas que inhibieron más del 40 % el crecimiento diametral del hongo, son; ’44 311’, ’35 111’, ’44 511’ y ‘6 51’. Después de 72 h de incubación, la levadura ’16 212’ manifestó un nivel de inhibición del hongo superior a 70 % y 67.1% a 96 h. Por su parte, la cepa ’35 113’, con niveles de inhibición de 53.8 %, continuó siendo junto con la anterior, la ‘6 51’ y la ’44 511’, una de las mejores en éste ensayo. Finalmente, si analizamos la inhibición del hongo por las distintas levaduras evaluadas considerando los distintos tiempos de incubación como repeticiones en el tiempo, se observa que las mejores levaduras resultaron nuevamente ’16 212’ y ’35 113’, con porcentajes de inhibición de 64.7 % y 53.2 %, respectivamente. En resumen, las cepas más sobresalientes en su poder de inhibición de Penicillium expansum, durante todos los tiempos de incubación, fueron: ’16 212’, ’35 111’, ‘6 51’, ’44 311’, ’44 511’, ’35 12’ y ’35 113’.

III. Bioensayos sobre frutos
De 140 cepas de levadura recuperadas de las manzanas, solo 104 fueron capaces de lograr concentraciones superiores a 1 X 107 UFC / ml después de 72 h de incubación en NYDB. Y sólo éstas fueron evaluadas en frutos.

Tabla 1. Comparación de medias para el desarrollo diametral (mm.) de P. expansum en función de la cepa de levadura en medio APD, en distintos tiempos de incubación

1 Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey-Kramer; p = 0.05)
2 Considerando los tiempos de incubación como repeticiones

1. Evaluación del antagonismo por grupos
En el grupo 1 (Tabla 2) dos cepas (’23 61’ y ’35 111’) redujeron significativamente el crecimiento del hongo después de cuatro días de incubación presentando inhibiciones en diámetro de 35.3 % y 33.6 %, respectivamente (58.1 % y 56.0 % en área, respectivamente) y, a los ocho días de incubación, la cepa ’23 61’ fue la única que presentó diferencias con el testigo (23.5 % de inhibición) de las 18 que conforman el grupo. Por otro lado, en este grupo se encontraban cuatro de las seis levaduras más sobresalientes in vitro. De éstas, únicamente la cepa ’35 111’ inhibió significativamente el crecimiento del hongo, aunque solo a cuatro días. Por el contrario, la cepa ’16 212’, la mejor in vitro, propició un nivel de severidad del hongo comparable al del testigo (a ocho días de incubación). Por todo lo anterior, solamente las cepa ‘35 111’, y ‘23-61’ fueron retenidas para la prueba confirmatoria (en negritas en la Tabla).
Dentro del grupo 2 (Tabla 3), cuatro cepas redujeron significativamente el crecimiento del hongo después de cuatro días de incubación, destacando la cepa ’26 224’ (57.1 % de inhibición). Ésta se mantuvo como la más sobresaliente dentro del grupo a los ocho y 12 días inhibiendo en 45 % y 28 %, respectivamente el crecimiento diametral del hongo (Figura 1).

Figura 1. Desarrollo de la lesión causada por P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en presencia de la cepa de levadura ‘26-224’ después de 12 días de incubación a 26° C

Tabla 2. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 1, a diferentes tiempos de incubación
Tabla 3. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 2, a diferentes tiempos de incubación

En el grupo 3, siete de las ocho levaduras presentaron diferencias con el testigo después de cuatro días de incubación (Tabla 4), de ellas, ’44 514’ y ’35 33’ fueron las más sobresalientes, aunque con niveles relativamente bajos de inhibición (30.6 % y 29.4 % respectivamente). Después de ocho días de incubación, solamente tres cepas inhibieron el crecimiento del hongo aunque con niveles muy bajos (‘44 514’ = 11.3 %, ‘35 33’ = 9.4 % y ‘44 513’ = 8.21 %).
Cuatro cepas mostraron un efecto sobre el hongo a los cuatro días de incubación, en el grupo 4 (Tabla 5), la cepa ’30 41’ fue la más efectiva. A los ocho días de incubación, ésta redujo en 36.1 % el crecimiento de P. expansum., en este mismo periodo destacó la levadura ’18 11’ con 23.0 % de inhibición. Cabe hacer notar que las cepas ’30 41’ y ’14 22’ son de las pocas que en los experimentos sobre frutos inhibieron significativamente a P. expansum después de 12 días de incubación.

Tabla 4. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 3, a diferentes tiempos de incubación
Tabla 5. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 4, a diferentes tiempos de incubación

En el grupo 5, la cepa ’38 432’ presentó un nivel de inhibición de 64.7 % a cuatro días de incubación (Tabla 6). Es levadura muy similar a ’26 224’ del grupo 2. Por otro lado, se encontraba la cepa ‘6 51’ que había mostrado un comportamiento aceptable in vitro, aquí mostró 18.8 % de inhibición del crecimiento del hongo, que junto con ’35 111’ del grupo 1 destacaron en ambos tipos de pruebas. A los ocho días de incubación, la cepa ’38 432’ volvió a destacar con 40.5 % de inhibición y, a los12 días, con 27 %, por el cual fue retenida para la prueba confirmatoria.
Por lo que respecta al grupo 6, de 11 levaduras probadas, solamente siete presentaron algún efecto sobre el crecimiento de P. expansum a los cuatro días de incubación (Tabla 7). De ellas, ’33 213’ fue la que mostró la mejor respuesta con una inhibición relativamente modesta (36.0 %). A ocho y 12 días de incubación no hubo efecto sobre el hongo.

Tabla 6. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 5, a diferentes tiempos de incubación
Tabla 7. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 6, a diferentes tiempos de incubación

En el grupo 7 (Tabla 8), las cepas ’4bco’ y ‘5vtt’ presentaron los mejores comportamientos de todos los grupos, con elevados niveles de inhibición (65.2 % y 57.39 %, respectivamente) después de cuatro días de incubación. Ambas cepas recuperadas de muestras de vinos blanco y tinto, respectivamente. A ocho días, la cepa ‘5vtt’ controló en 46 % el crecimiento del hongo, mientras que la cepa ‘4bco’ lo hizo en 25 %. A los 12 días de incubación, la cepa ‘5-vtt’ se mantuvo como la más efectiva. A modo de comparación, podemos citar que Teixidó et al. (1998b) obtuvieron, después de siete días de incubación, índices de control de pudrición de 68 % a partir de una cepa de Candida sake aislada de manzana, pero crecida en medios de cultivo que contenían glicerol con la finalidad de buscar resistencia a actividades de agua bajas. Este resultado supera a lo obtenido en el presente trabajo con las levaduras más sobresalientes. Cabe señalar que, la medición del diámetro de la lesión a los ocho días, pudiera ser la más representativa y comparativa, ya que es el tiempo al que otros autores miden la severidad en el fruto (Janisiewicz y Roitman, 1988; ñas et al., 1998).
En lo correspondiente al grupo 8 (Tabla 9), siete presentaron efecto sobre el crecimiento del hongo a los cuatro días de incubación, de ellas destacan ’26-115’ y ‘27-110’ con una reducción de la severidad de la lesión de 35.5 % en ambos casos. A los ocho días de análisis, ‘27-110’ mostró el nivel más alto de inhibición (28.0 %).

Tabla 8. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 7, a diferentes tiempos de incubación
Tabla 9. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 8, a diferentes tiempos de incubación

Finalmente en el grupo 9, la cepa ‘27-117’ sobresalió con una inhibición de 36.4 % después de cuatro días de incubación (Tabla 10). Otras ocho cepas mostraron efecto sobre el crecimiento de P. expansum a este tiempo. No obstante, ni a ocho ni a 12 días se mostró efecto por las cepas.

Tabla 10. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura del grupo 9, a diferentes tiempos de incubación

En resumen, las levaduras seleccionadas para la prueba confirmatoria fueron las 12 siguientes: ‘35-111’, ‘23-61’, ‘26-224’, ‘26-312’, ‘44-514’, ‘30-41’, ’18 11’, ’38 432’, ’33 312’, ‘5-vtt’, ‘4bco’ y ‘27-119’. Dos de éstas fueron extraídas de muestras de vino elaboradas en el laboratorio de fisiología de poscosecha de la UAQ; las otras diez fueron recuperadas de manzanas de San Joaquín y Cadereyta; ninguna de las levaduras obtenidas de manzanas de INIFAP presentó un comportamiento notable. Otros autores han recuperado cepas de levaduras con capacidad antagónica de productos diferentes a la superficie de la manzana (Janisiewicz, 1987; Nunes et al., 2001).

2. Prueba confirmatoria con manzana de exportación
- Cuatro días de incubación. La cepa ’23-61’ presentó sorpresivamente el más alto nivel de inhibición del crecimiento del hongo (93.5 %), superando en más de 50 % la inhibición que obtuvo en la prueba precedente. Por su parte, la cepa ‘5vtt’ mostró una inhibición del crecimiento del hongo de 88.2 %, superando en casi 30 % su comportamiento cuando fue evaluada por primera vez. El resto de las cepas mantuvieron niveles de inhibición muy semejantes a los que manifestaron en la primera prueba (Tabla 11).
-Ocho días de incubación. Nuevamente la cepa ‘23-61’ presentó el mayor nivel de control del crecimiento del hongo. Ésta y la ‘5vtt’ manifestaron porcentajes de inhibición superiores a 50 %, nivel no alcanzado por ninguna de las levaduras en la prueba anterior a este tiempo. Por su parte, las cepas ‘4bco’ y ’38-432’ obtuvieron niveles aceptables de inhibición. Por el contrario, la cepa ‘33-213’ no inhibió el crecimiento del hongo.

Tabla 11. Desarrollo diametral (cm.) de P. expansum en manzanas ‘Golden Delicious’ en función de la cepa de levadura a diferentes tiempos de incubación

- Doce días de incubación. Solamente seis de las 12 levaduras probadas presentaron algún nivel significativo de control del crecimiento de P. expansum. Las cepas ‘23-61’ y ‘5vtt’ inhibieron al hongo en un porcentaje importante (29.8 y 23.4 %, respectivamente). Estas dos cepas fueron las más sobresalientes en la prueba confirmatoria y, en el caso de ‘5vtt’, debemos recordar que presentó los mas altos niveles de control en la prueba previa. En contraparte, la cepa ‘33-213’ no inhibió el crecimiento del hongo. Es de hacer notar que la cepa ’26-224’ que en el experimento precedente había controlado en 28 % al patógeno, en el presente ensayo no tuvo efecto alguno después de 12 días de incubación. Esta respuesta puede estar relacionada con el hecho de que la fruta había presentado desde los ocho días de incubación daños que fueron gradualmente cubiertos por el desarrollo propio del hongo.
Estos comportamientos son comparables a los obtenidos por dos cepas aisladas por Janisiewicz (1987) que manifestaron inhibiciones cercanas a 90 % después de seis días de incubación. También, mantuvo en incubación por 14 días a manzanas heridas y protegidas con una cepa potencialmente antagónica de Pseudomonas spp. encontrando que ésta presentó un nivel de inhibición comparable al obtenido después de seis días de incubación (mas del 70 % de inhibición). Podemos ver que la respuesta de las distintas levaduras evaluadas en el presente trabajo resulta muy inferior a la obtenida por Janisiewicz, aunque se debe aclarar que éste había realizado un proceso previo de selección con 933 cepas de levaduras. ñas et al. (1998) obtuvieron, después de siete días de incubación, 40 % de cepas con inhibición significativa (de 933 probadas), y 9.6 % de ellas redujeron el crecimiento del hongo sobre las manzanas en más de 50 %. Nosotros en los experimentos por grupos, a ocho días de incubación, solamente 38.5 % de las levaduras mostró una inhibición significativa del patógeno, y ninguna de éstas redujo el crecimiento del hongo en más de 50 % y, por el contrario, en la prueba confirmatoria dos cepas superaron este nivel. Janisiewicz (1988) probo 534 aislados de bacterias y levaduras y solamente una cepa logró mas de 50 % de inhibición sobre Botrytis cinerea, identificada como Acremonium breve, actualmente esta cepa en conjunto con otra bacteria, son la base del producto comercial Aspire®. Y previamente en 1987 de mas de 800 aislados probados solamente obtuvo dos cepas con inhibiciones de mas del 80 %, identificadas como la bacteria Pseudomonas spp. y una levadura blanca (Janisiewicz, 1987)

IV. Correlación entre los bioensayos in vitro y en frutos
Las únicas correlaciones significativas observadas, se presentaron entre distintos tiempos de incubación dentro de un mismo tipo de experimento, específicamente entre el crecimiento diametral del hongo in vitro a 96 h y a 120 h (r = 0.9831, p = 0.05) (Tabla 12). A 72 h de incubación in vitro con ocho días de incubación sobre fruto, el índice de correlación fue muy bajo (r = 0.1103, p = 0.05). Esta ausencia de correlación se ilustra en la Fig. 2 donde, los puntos correspondientes a cada uno de las 38 cepas de levadura se encuentran muy dispersos con relación a la recta. La ausencia de correlación entre el comportamiento de las levaduras in vitro y en frutos probablemente se deba a que las levaduras son capaces de desarrollar distintos mecanismos de antagonismo, según el caso. En efecto, se ha demostrado que cepas de levaduras antagónicas son capaces de inducir respuestas de resistencia en el tejido del huésped, tal es el caso de Pichia guillermondii (US-7) usada en manzanas, duraznos y cítricos que induce la síntesis de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) y de la fitoalexina ‘Scoparon’ en la piel de fruto, como respuesta de defensa (Wilson et al., 1994). Es probable que, en presencia del fruto, las levaduras sobresalientes actúen primordialmente induciendo algún mecanismo de resistencia en el huésped mientras que in vitro, la inhibición del crecimiento del hongo se deba fundamentalmente a una competencia por nutrientes y por espacio, como lo han sugerido diversos autores (Janisiewicz, 1987; ñas et al., 1998; El Ghaouth et al.,1998; Nunes et al., 2001). En la misma Tabla se observa una ausencia de correlación entre la velocidad de crecimiento de la levadura a las 72 horas de crecimiento en NYDB con los resultados obtenidos en ambos experimentos, resultado que es incompatible con la idea de la velocidad de crecimiento de la levadura como probable mecanismo de inhibición del crecimientos del hongo, algo que previamente habíamos sugerido.
Una desventaja de los experimentos in vitro es que, identifica antagonistas potenciales productores de antibióticos o enzimas líticas, y no selecciona antagonistas con otro tipo de mecanismo de acción, como la competencia por nutrientes y el parasitismo directo (ñas et al., 1998). La falta de consistencia en el comportamiento de las levaduras en ambos tipos de experimentos coincide sensiblemente con Janisiewicz (1987) quien no detectó, en general, una buena respuesta en fruto de cepas de levadura que habían destacado en pruebas in vitro.

Tabla 12. Coeficiente de correlación simple1 entre los tiempos de
análisis in vitro , sobre fruto y velocidad de crecimiento.

V. Identificación de las cepas con mayor capacidad antagónica
Se logró reconocer a cuatro de las seis cepas de levaduras que presentaron la mayor inhibición del crecimiento del hongo en los experimentos sobre frutos por el sistema de identificación Biolog® (Tabla 13). El sistema especifica que se requiere un Índice de similitud-Biolog (IS) con la base de datos del sistema de al menos 0.5 para que la lectura sea considerada confiable (BIOLOG 2001). Una cepa más (‘26 224’) pudo ser identificada, por medio de la observación de su morfología colonial y microscópica y, desgraciadamente una mas (‘23-61’) no se logro identificar.

Figura 2 Correlación entre el desarrollo de P. expansum a 72 horas in vitro con ocho días en fruto.

Tabla 13. Identificación de las cepas de levadura sobresalientes en ensayos sobre frutos

Candida incommunis no ha sido reportada aún como potencial antagonista en enfermedades de poscosecha, sin embargo, existen otras especies de Candida reportadas como agentes potenciales de control de daños en poscosecha (Mercier y Wilson, 1994; Wilson et al., 1995). Debaryomyces hansenii ha sido reportada como potencial antagónico contra pudriciones de poscosecha en cítricos y tomates (El-Ghaouth et al., 2002). Cryptococcus albidus, ha sido reportada como agente de control de moho azul en manzanas, y contra la pudrición de Mucor en peras (Wisniewski y Wilson, 1992). Pichia membranaefaciens no ha sido reportada contra patógenos de poscosecha, sin embargo otras especies de Pichia ya han mostrado un control en pudriciones de poscosecha, entre ellas, P. guillermoundii contra pudriciones en manzanas, cítricos, uvas y tomate (El Ghaouth et al., 2002).

Conclusiones

1. 1. La cepa ‘16-212’ fue la que mostró el mayor poder antagónico sobre Penicillium expansum in vitro con inhibiciones del crecimiento diametral del hongo de más de 70 % después de 72 hrs. de incubación.
2. La cepa ‘5vtt’ manifestó el mayor poder inhibitorio sobre P. expansum en experimentos realizados en frutos. ‘5vtt’ mostró niveles de inhibición de 88, 50 y 23 % en los tres tiempos de incubación considerados.
3. En la prueba con manzana de exportación (prueba confirmatoria) las cepas ’23 61’ y ‘5vtt’ manifestaron un poder de inhibición mucho mayor en comparación con el mostrado en la prueba previa por grupos. ‘5vtt’ mostró niveles de inhibición de 88, 50 y 23 % en los tres tiempos de incubación considerados.
4. Los análisis estadísticos mostraron una ausencia de correlación entre el poder antagónico de las levaduras observado en medio de cultivo y el observado en frutos. Este resultado sugiere que las levaduras que presentan un elevado poder antagónico en fruto deben interactuar con el huésped para ejercer su efecto.
5. El sistema Biolog® fue capaz de identificar a nivel de especie a cuatro de las seis mejores cepas evaluadas, correspondiendo ‘5vtt’ a Candidad incommunis, ‘38-432’ a Debaryomyces hansenii C, 35 111’ a Cryptococcus albidus.
6. La cepa ‘26-224’ fue identificada a nivel de género, a partir de la observación microscópica y con base en los manuales de identificación, como Torulaspora.