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Metodología
Preparación enzimática y muestras utilizadas
Se utilizó la preparación enzimática comercial Maxilact LX 5000 (Gist
Brocades, Delft, Holanda) como fuente de  -galactosidasa de K. lactis, la cual fue
analizada y sometida a purificación por isoelectroenfoque, utilizando reactivos de
Bio Rad, Hercules, CA. Las fracciones con actividad de lactasa se sometieron a
ultrafiltración para evitar la interferencia del anfolito en la técnica de electroforesis.
La -lactoglobulina lactosilada utilizada se preparó en el laboratorio
glicosilando -lactoglobulina nativa calentándola a 75°C durante 30 min en
presencia de 5% de lactosa, según Léonil et al. (1997).
Análisis
La determinación de proteína se hizo por medio del método de Bradford-
Espectrofotometría visible (595 nm), según Bradford (1976). El reactivo de Bradford
utilizado era de Bio Rad, Hercules, CA.
La actividad enzimática de la -galactosidasa se determinó por
cuantificación de ONP (ortonitrofenol)-Espectrofotometría visible (410 nm), según
Jiménez-Guzmán et al. (2002). Se utilizó una solución de o-nitro-fenil-b-Dgalactósido
0.034 M (ONPG, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como sustrato, en
soln. amortiguadora de fosfatos 0.05 M a pH 7 y se registró la liberación de ONP al
medio. En el caso de las mezclas de reacción, se utilizaron soluciones de 0.3 y 3
mg/mL de -lactoglobulina y seroalbúmina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
en solución amortiguadora de fosfatos 0.05 M, pH 7.
Las electroforesis nativas y desnaturalizantes se realizaron utilizando geles
de poliacrilamida con diferentes proporciones de arcrilamida/bisacrilamida (T =
7.5, 10, 11 y 12.5%) y reactivos de Bio Rad, Hercules, CA. Los geles se corrieron a
200 V y se utilizó 4-metil-umbiliferil-b-D-galactósido (Sigma Chemical Co, St.
Louis, MO) como sustrato para la determinación de la actividad in situ de la -
galactosidasa en gel de electroforesis, según Brady et al. (1995).
Equipo utilizado
En todos los análisis, se utilizaron micropipetas de 0.1-10 µL, 40-200 µL y 200-
1000 µL. Las absorbancias se leyeron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160A
y en los casos en los que fue necesario mantener la temperatura constante se utilizó
un controlador de temperatura Shimadzu TCC-240A.
En las electroforesis se utilizó una cámara de electroforesis Mini-Protean III
con una fuente de poder Power/Pac 300 de Bio Rad. Los geles se agitaron e
incubaron para lograr la eliminación del frente y la tinción en un Incubator Shaker
Series 25 de New Brunswick Scientific Co. Inc. Para el análisis de los geles se
utilizó un equipo Gel Doc 1000, Single Wavelength Mini-Transilluminator de Bio
Rad, con una interfase a una computadora Pentium con el Molecular Analyst
Software, Versión 1.5. Se utilizó también un equipo de FPLC (Fast Performance
Liquid Cromatography) de Bio Rad.
Para la purificación de la preparación enzimática, se utilizó un Rotofor con
una fuente de poder Power/Pac 3000 de Bio Rad y un sistema refrigerante a 4°C.
La ultrafiltración se realizó en membranas de celulosa Minitan Acrylic ltrafilter
System, 10000 nominal molecular weight limit de Millipore, utilizando una
centrífuga J500 Sol-Bat.
Diseño experimental y modelo estadístico
Las curvas patrón se hicieron por triplicado, utilizando una regresión lineal
para obtener la ecuación de la recta y tomando como referencia de confiabilidad el
coeficiente de correlación (r2) de dicha ecuación (con un valor ³ 0.9) y la desviación
estándar (s). Cada experimento se realizó por triplicado y los resultados se
sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y en algunos casos a una prueba de
comparación de medias de Tukey, con un rango de error (a) de 5%, utilizando el
software Statistica para Windows.
Resultados y Discusión
Caracterización y purificación de la preparación comercial Maxilact LX 5000.
Para caracterizar a la preparación Maxilact LX 5000, primero se determinó la
concentración de proteína, posteriormente se realizó la determinación de actividad
enzimática y a partir de estos datos se calculó la actividad específica, definiendo a
las UE (unidades enzimáticas) de -galactosidasa de K. lactis como la cantidad de
enzima necesaria para hidrolizar una mmol de ONPG (o-nitro-fenil-b-Dgalactósido)
en un segundo a 37°C y pH 7. La tabla 1 muestra los resultados
obtenidos en cada uno de los parámetros determinados al Maxilact LX 5000.
Tabla 1. Resultados obtenidos en las determinaciones realizadas a la preparación
comercial Maxilact LX 5000 para su caracterización.
MAXILACT LX 5000
Determinación:
Proteína (mg/mL): 52
Vo (mmolONP/mL s): 0.0152
Actividad específica (UE/mg proteína): 1.7716
Actividad volumétrica (UE/mL): 0.4121
Para seguir con la caracterización, se determinó la pureza de la preparación
por medio de electroforesis “nativa” en gel de poliacrilamida, observando que esta
preparación es una mezcla compuesta por siete proteínas diferentes con los
siguientes pesos moleculares: 160, 123, 103, 95, 81, 73 y 64 kDa.
Diversos autores han reportado que la -galactosidasa de K. lactis es un
dímero y que ésta es su forma más activa, difiriendo entre ellos sólo en el peso
molecular de los monómeros. Por un lado, Dickson et al. (1979) y Becerra et al.
(1998) encontraron que el peso molecular de cada monómero era de 124 ± 10 kDa y
este resultado coincide en peso con una de las proteínas de la preparación
comercial (PM = 123 kDa). Cavaille y Combes (1995), por su parte, reportan que la enzima en su forma dimérica pesa alrededor de 200 kDa; se observa que dos de las
proteínas del Maxilact LX 5000 (PM = 95 y 103 kDa) coinciden de manera
aproximada con la forma monomérica de la lactasa que reportan estos autores. Sin
embargo, hasta este punto no podemos asegurar que estas proteínas presenten
actividad de lactasa o saber cuáles de ellas la presentan. Lo que es claro es que
ninguna de las proteínas de la preparación comercial coincide con las formas
diméricas reportadas, por lo que quizá se trate de otra(s) -galactosidasa(s)
igualmente producidas por esta levadura.
Para identificar cuál o cuáles de las proteínas observadas en el gel de
poliacrilamida presentaban actividad de lactasa se realizó un zimograma, sin
embargo, no se pudo determinar la actividad enzimática in situ ya que utilizando
un gel de poliacrilamida de T = 7.5% no se retenía el reactivo utilizado (4-metilumbiliferil-
b-D-galactósido) en el gel y la fluorescencia se observaba en el buffer.
Cuando se utilizó un gel de T = 10% y 11% no se logró separación de las bandas
del Maxilact, por lo que tampoco así se distinguía(n) la(s) proteína(s) con actividad
de lactasa.
Para purificar la preparación comercial, se corrió el Rotofor y se obtuvieron 20
fracciones de aproximadamente un mililitro.
Tabla 2. Caracterización de las fracciones con actividad de lactasa, obtenidas
después de someter al Maxilact LX 5000 a purificación por isoelectroenfoque.
Primero se les determinó el pH a las fracciones obtenidas para saber el punto
isoeléctrico (pI) de las proteínas presentes. Por medio de un ensayo enzimático
cualitativo, utilizando ONPG, se descartaron aquellas fracciones que no
presentaban actividad de lactasa, quedando sólo siete cuyo resultado fue positivo
(fracciones 5 a 11). Cada una de las fracciones que presentaron actividad de lactasa
se caracterizó y los resultados para cada parámetro determinado se muestran en la
tabla 2. Las -galactosidasas en las fracciones 8, 9 y 10, que se encuentran dentro de
un rango de pH cercano a la neutralidad (6.28 a 6.96), presentaron las mayores
actividades específicas. Sin embargo, los datos obtenidos sugieren que en la
preparación enzimática Maxilact LX 5000 existe otra proteína con un pI más bajo
(entre 4.5 y 6) que también tiene actividad de lactasa, pero su actividad específica
es menor a las de las fracciones antes mencionadas, ya que no se logró purificar
totalmente con el método utilizado.
Por medio de una electroforesis nativa en gel de poliacrilamida T = 7.5% se
observó que solamente las fracciones 8, 9 y 10 estaban puras, aunque para el resto
del estudio se utilizó la -galactosidasa de la fracción 9 (pI = 6.69) por haber
presentado la máxima actividad específica.
Se realizó una electroforesis nativa en gel de poliacrilamida para determinar
el peso molecular de esta lactasa pura; el gel obtenido se muestra en la figura 1.
De acuerdo con la curva patrón de pesos moleculares, la -galactosidasa
presente en la fracción 9 tiene un peso molecular aproximado de 83 kDa y se
comprobó que la muestra estaba pura, ya que sólo se observa una banda
proteínica en el gel (carril 2, figura 1).
Para observar si la enzima estaba formada por una o varias proteínas, se
realizó una electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida, en la que se
observó que la -galactosidasa obtenida a partir de la purificación (fracción 9) era
un dímero, ya que se aprecian claramente dos bandas proteínicas en el gel (carril 4;
figura 2). Los pesos moleculares aproximados de los monómeros fueron de 54 y 48
kDa.
podría corresponder a uno de los monómeros de la enzima, con lo que se reitera
que la enzima estaba pura y además que es un dímero como lo indicó el gel de
electroforesis (figura 2).
Interacción entre la -galactosidasa y las proteínas del suero
Se realizaron mediciones de actividad enzimática para determinar el efecto de
la -lactoglobulina (-lg) y la seroalbúmina (SA) sobre la enzima -galactosidasa.
Se adicionó el medio de reacción con dos concentraciones diferentes de estas
proteínas del suero, las cuales se decidieron con base en las concentraciones a las
que éstas se encuentran de manera natural en el mismo, esto es, 3 mg/mL en el
caso de la -lg y 0.3 mg/mL para la SA, y cada concentración se probó para ambas
proteínas.
La actividad obtenida para la -galactosidasa en medios de reacción en los
que las proteínas del suero estaban presentes fue significativamente mayor que
aquella obtenida en solución amortiguadora, como se observa en la figura 4.
El análisis estadístico aplicado a estos resultados indicó que siempre que hubo
-lg ó SA presente en el medio de reacción, la actividad de la -galactosidasa
aumentó significativamente (a = 0.0001) a las dos concentraciones probadas (figura
4). Ahora bien, si sólo nos enfocamos al efecto de la presencia de las proteínas,
aparentemente no hay diferencia significativa entre la -lg y la SA (a = 0.3235), sin
embargo, al analizar el efecto de la concentración de estas proteínas se observa una
diferencia (figura 4): cuando se utilizó una mayor concentración de -lg (3
mg/mL), su efecto activador fue mayor que aquél obtenida con la menor
concentración de ella (0.3 mg/mL), efecto que fue inverso para la SA.
Al comparar los resultados entre ellas tenemos que: a menor concentración
(0.3 mg/mL), la SA presenta un efecto activador sobre la lactasa equivalente al de
la mayor concentración (3 mg/mL) de -lg (a = 0.9999); y al aumentar la
concentración de SA a 3 mg/mL, se obtiene un efecto activador equivalente al de la
menor concentración de -lg (0.3 mg/mL) (a = 0.6133). Este efecto activador
equivalente para las dos proteínas a diferentes concentraciones puede estar
vinculado con la relación entre el tamaño de la proteína presente y el impedimento
estérico, que limita la movilidad de la enzima, del sustrato y de las mismas
proteínas en el medio de reacción. Por otro lado, las concentraciones de cada
proteína con las que se obtuvo una mayor activación de la enzima coinciden con la
concentración natural a la que se encuentran estas proteínas en el suero de leche.
Para evaluar si este aumento en la actividad de la -galactosidasa de K. lactis
se debía a una interacción enzima-proteína, se estudiaron los cambios en los
patrones electroforéticos de la lactasa pura en presencia de estas proteínas del
suero. Se estudió también el efecto de la -lactoglobulina lactosilada (-lglac), ya
que existen antecedentes en el laboratorio de que al lactosilarse podría perder su
capacidad activadora sobre la -galactosidasa, debido a que la lactosa podría
ocupar el sitio de unión con la enzima.
Al analizar los geles obtenidos, se observó la aparición de bandas nuevas de
282.5 kDa en el caso de la seroalbúmina (carril 2, figura 5a), de 99.3 kDa para la -
lactoglobulina (carril 5, figura 5b) y de 160.7 y 122.6 kDa para la -lactoglobulina
lactosilada (carril 7, figura 5b), las cuales podrían deberse a la unión entre la
enzima y la proteína del suero.
Figura 5. Electroforesis nativa en gel de poliacrilamida, teñido con Sypro Orange
Protein Stain : a) para seroalbúmina, gel de T = 7.5% ; b) para -lactoglobulina y
-lactoglobulina lactosilada, gel de T = 12.5%.
Con la finalidad de evitar un análisis únicamente subjetivo, se realizó un
análisis de perfil de proteínas a los geles por medio del software del Gel Doc. En
cada caso, se comparó el perfil obtenido de la proteína del suero sola con el de la
proteína del suero a la que se le añadió -galactosidasa pura.
En el caso de la -lg nativa se observa la presencia de un pico “nuevo”, es
decir, que no se encuentra en el control (figura 6a). La migración registrada para
este pico coincide con la aparición de la banda nueva (carril 5, figura 5b); los 99.3
kDa de esta banda podrían ser el resultado de una -lactoglobulina (18.3 kDa)
unida molecularmente a la -galactosidasa pura (81 kDa), siendo esta interacción la
responsable de activar a la enzima. Trabajos anteriores han sugerido que quizá el
sitio de unión sea la Lys47 de la -lactoglobulina (Jiménez-Guzmán, 2003), ya que
este aminoácido se localiza muy cerca de una prolina que provoca una torsión en
la cadena polipeptídica, haciendo que la Lys47 esté más expuesta y reaccione
fácilmente.
Para el caso de la -lg lactosilada, la presencia de nuevas señales no es tan
evidente de primera instancia, sin embargo, al comparar ambos perfiles
minuciosamente sí se observan 2 nuevas señales (figura 6b), cuya migración
coincide con las dos nuevas bandas de alto peso molecular que se aprecian en el
gel (carril 7, figura 5b). La primera banda proteínica (160.7 kDa) correspondería en
peso a cuatro -lactoglobulinas lactosiladas (con una lactosa) unidas a la -
galactosidasa pura y haciendo este mismo análisis para la segunda banda nueva
(122.6 kDa) se tiene que matemáticamente la lactasa estaría unida a dos -
lactoglobulinas lactosiladas.
Tomando en cuenta que la -lactoglobulina es una proteína termolábil que fue
sometida a un tratamiento térmico prolongado para lograr la lactosilación y que
esto provoca formación de agregados entre las -lg desnaturalizadas (Iametti et al.,
1996; Owusu y Galani, 2000), quizá entonces la interacción con la lactasa se esté
dando con una sola de estas proteínas y ésta a su vez se encuentra formando un
agregado con otra u otras -lactoglobulinas desnaturalizadas, lo cual aumentaría el
tamaño y peso pero no necesariamente el número de interacciones con la enzima.
Ahora bien, según Léonil et al. (1997) con un calentamiento de 75°C por 30
min como el que se aplicó en este caso, se logra un máximo de lactosilación de la -
lg de 35% y este proceso ocurre más fácilmente en la Lys47 por estar más expuesta.
Por tanto, existen en el medio -lactoglobulinas no lactosiladas pero sí
desnaturalizadas y si tomamos en cuenta que se ha sugerido que la Lys47 también
es el sitio de unión entre esta proteína del suero y la enzima, luego entonces la
interacción en este caso (-lglac + lactasa) podría darse en la Lys47 de una -
lactoglobulina que no fue lactosilada durante la glicosilación o podría estar
cambiando el sitio de unión. Y ya que se ha reportado que la lactosilación de la -lg
disminuye su capacidad de unirse a la enzima (Jiménez-Guzmán, 2003), existen
menores posibilidades de interacción y por ello, las nuevas bandas en el gel se
observan más tenues que en el caso de la -lg sin lactosilar (carril 5 y 7, figura 5b).
Es importante mencionar que después de someter a la -lg a la lactosilación
pueden ocurrir un sinnúmero de fenómenos imperceptibles y sin explicación hasta
el momento, por lo que además de lo que aquí se ha propuesto que haya sucedido
pueden existir muchas otras posibilidades ocurriendo a la vez.
En el caso de la seroalbúmina, la comparación entre ambos perfiles de
proteínas no evidenció la presencia de nuevas señales, sin embargo, en el gel (carril
2, figura 5a) se observa una banda nueva muy tenue de peso molecular elevado.
Esta banda aparece prácticamente al principio del gel de separación, siendo esto
una posible explicación al hecho de que no aparezca en el análisis de perfil de
proteínas (figura no se muestra), y tiene un peso molecular aproximado de 282.5
kDa, lo cual matemáticamente corresponde a tres moléculas de SA unidas a la
enzima. No es posible dar una explicación clara a este hecho, ya que no se ha
reportado evidencia de formación de agregados entre moléculas de SA o de
posibles sitios de unión con otras moléculas. Este hallazgo requiere de más
estudios capaces de ahondar en esta interacción entre la lactasa y la seroalbúmina.
Conclusiones
La -galactosidasa purificada a partir del Maxilact LX 5000 (pI = 6.69) es un
dímero formado por subunidades de 54 y 48 kDa.
Las dos concentraciones probadas de -lactoglobulina y seroalbúmina,
proteínas del suero de la leche, activaron a la -galactosidasa de Kluyveromyces
lactis y las interacciones que se establecen entre la enzima y estas proteínas del
suero y que muy probablemente son las responsables de su activación, se dan en
diferentes proporciones. En el caso de la -lactoglobulina nativa, se observó una
interacción con la enzima en una relación 1:1, mientras que para la -lactoglobulina
lactosilada la interacción con la enzima posiblemente sea con una -lg no
lactosilada que a su vez está formando agregados de dos o cuatro moléculas con
otras -lactoglobulinas. Se comprobó que las modificaciones estructurales sí
afectan al comportamiento de esta proteína, ya que los resultados obtenidos para la
-lactoglobulina lactosilada y la -lactoglobulina libre fueron diferentes. En el caso
de la seroalbúmina, los resultados sugirieron que son tres moléculas de SA las que
se unen a la enzima.
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PREMIOS 2004 
= 0.0001). De las dos concentraciones probadas(0.3 y 3 mg/mL), el mayor efecto activador en cada caso coincide con la concentración a la que estas proteínas se encuentran de manera natural en la leche.