Los Ustilaginales constituyen un grupo importante de fitopatógenos debido a que ocasionan enfermedades en monocotiledóneas de todo el mundo. A pesar de los tratamientos químicos aplicados a semillas y cultivos y la existencia de variedades de resistentes, estos hongos, han sido considerados como la causa potencial del carbón de las plantas (Ruiz-Herrera y Martínez-Espinoza, 1998; Agrios, 1999).
Dentro de este grupo de hongos, Ustilago maydis mejor conocido en nuestro país como huitlacoche o cuitlacoche (del náhuatl cuitlatl, excremento y chochini, dormir) causa el carbón del maíz, una enfermedad de distribución mundial, la cual bajo ciertas condiciones ocasiona numerosas pérdidas económicas. En la parte central de México el carbón que invade al maíz dulce, el “huitlacoche” es considerado un platillo exquisito desde el periodo pre-colombino y recientemente ha sido introducido a platillos de alta cocina con bastante aceptación. (Herrera y Ulloa, 1990; Ruiz-Herrera y Martínez-Espinoza, 1998). Los estudios que se realizan actualmente a nivel mundial en Ustilago maydis están enfocados al control de la enfermedad fitopatógena sin embargo en nuestro país queremos abordar el estudio de este hongo desde el punto de vista alimenticio. Por otro lado, Ustilago maydis es un modelo atractivo de estudio ya que es un hongo dimórfico accesible a las técnicas bioquímicas y de biología molecular. Se sabe en general que las proteasas juegan un papel importante en el ciclo de vida de los hongos y por otro lado se ha investigado el papel de las proteasas en la maduración y fermentación de alimentos, principalmente en lácteos y embutidos, ya que estas enzimas participan activamente en la generación de péptidos y aminoácidos que contribuyen con el sabor del alimento. En el caso de U. maydis antes de este trabajo no sabíamos nada acerca de sus enzimas proteolíticas.

1. Determinar la presencia de protesas intracelulares y extracelulares en el hongo U. maydis: proteasa A, protesa B, aminopeptidasa y dipeptidil aminopeptidasa
2. Purificar y caracterizar bioquímicamente la proteasa A extracelular (pumAe)
3. Purificar y caracterizar bioquímicamente la proteasa A intracelular (pumAi)
4. Purificar y caracterizar bioquímicamente la aminopeptidasa intracelular (pumAPEi)
5. Discutir el posible papel de dichas proteasas durante el ciclo de vida del hongo para el establecimiento de la infección y por lo tanto formación del “huitlacoche”, así como el papel de las proteasas en las características nutricionales y sensoriales (sabor) de dicho alimento.

Debido a que el “huitlacoche” es un alimento considerado exquisito desde el periodo pre-colombino, con una gran aceptación en nuestros días y que recientemente ha sido introducido a platillos de alta cocina nacional e internacional, hemos decidido estudiar a las proteasas del hongo Ustilago maydis, responsable del carbón que invade al maíz dulce.
El estudio de las proteasas de este hongo permitirá establecer el papel que desempeñan dichas enzimas en el establecimiento de la infección del maíz por el hongo, y por lo tanto la formación del “huitlacoche”, así como el posible papel en la generación de características organolépticas del alimento, específicamente su sabor originado por los péptidos y aminoácidos liberados. Los resultados bioquímicos podrán relacionarse con los resultados del proyecto genoma de Ustilago maydis, cuya secuencia nucleotídica será liberada por la empresa BAYER próximamente. Las bases de datos permitirán desarrollar estrategias de clonación de genes de enzimas proteolíticas para estudiar y manipular la expresión de dichos genes y construir cepas mejoradas de U. maydis con un comportamiento predecible en cuanto a la capacidad de infección del maíz, formación del huitlacoche y con características sensoriales y nutricionales predecibles.
Pretendemos con este trabajo abordar el estudio de Ustilago maydis como un hongo importante para la alimentación a diferencia del enfoque que se le ha dado en el extranjero ya que dichas investigaciones están enfocadas al hongo como un fitopatógeno.

Metodología

Cepas utilizadas. Se utilizaron 2 cepas haploides de Ustilago maydis (FB1 y FB2), las cuales fueron donadas por la Dra. Flora Banuett de la Universidad de San Francisco California.
Medios y condiciones de de Cultivo. Las cepas fueron crecidas en medio liquido YEPD (Extracto de levadura 1%, bactopeptona 2% y dextrosa 2%) o en medio mínimo YNB (Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio 0.17%) con diferentes fuentes de nitrógeno al 2%: peptona, prolina, sulfato de amonio o infusión de maíz (ésta última con el equivalente a 4 mg de proteína por ml). Las células fueron inoculadas en medio líquido a pH 7 para la obtención de una población homogénea de levaduras o a pH 3 para micelio, (Ruiz-Herrera y col., 1995). El crecimiento celular se siguió por la cuantificación de la proteína total según el método descrito por Lowry (1976).
Ensayos enzimáticos. Los extractos enzimáticos fueron preparados como fue descrito por Arbesú y col., en 1993. Las actividades proteolíticas fueron determinadas según los métodos descritos por Hirsch y col., en 1989. Los siguientes substratos fueron utilizados para la determinación de las proteasas: Hemoglobina desnaturalizada a pH ácido (Hb), para la actividad de proteinasa pumA; Hide Powder Azure (HPA), para la proteinasa pumB; L-Lisina-4-nitroanilida (Lys-4-NA) para la actividad de aminopeptidasa pumAPE y L-alanina-prolina-4-nitroanilida (Ala-pro-4-NA) para dipeptidilaminopeptidasa (pumDAP). La activación de los extractos crudos se llevó a cabo como fue descrito por Saheky y Holzer en 1975. La actividad de pumAPE en geles de poliacrilamida en condiciones nativas, fue detectada utilizando el substrato L-Lisina-ß-naftilamida (Lys-ß-NphA) y Fast Garnet (García-Álvarez y col., en 1991). La obtención de un extracto crudo de inhibidor se realizó como fue descrito por Escudero y col., en 1993. Como marcador enzimático de localización intracelular se determinó la actividad de Enolasa utilizando ácido D-glicerico 2-fosfato como substrato, según el método descrito por Dimitriy y Nowak en 1998.
Todos los sustratos utilizados en este trabajo fueron obtenidos de las casas comerciales Sigma (St. Louis, MO, USA) o Bachem (King of Prusia, PA, USA) y los inhibidores específicos de proteasas de Böehringer Mannheim (Indianápolis, IN, USA). Los datos reportados son representativos de al menos tres diferentes experimentos con determinaciones en duplicado.
Microscopía de luz y electrónica de barrido. Las células fueron observadas en preparaciones no teñidas en un microscopio diferencial de interferencias. La microscopía electrónica de barrido (SEM) se realizó como describe Mercado-Flores y col., (2003b).
Purificación de la proteasas de U. maydis. Todas las manipulaciones y separaciones cromatográficas fueron llevadas a cabo utilizando el sistema FPLC (Amersham Biosciences LTD, UK) a 4ºC. Para la purificación de la proteinasa pumAe la cepa de U. maydis FB1 fue cultivada en medio mínimo suplementado con (NH4)2SO4 durante 48 h y para la purificación de la proteinasa pumAi y pumAPE en medio YPD durante 24 horas.
Purificación de la proteinasa pumAe (extracelular). El sobrenadante del medio de cultivo fue liofilizado y el producto obtenido fue disuelto en regulador de fosfatos, pH 7, fue sometido a una precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 al 60-80% de saturación. El precipitado colectado por centrifugación (12000 X g a 4ºC) y disuelto en el mismo regulador, se sometió a un segundo paso de precipitación al 50 y 90% de saturación. El precipitado fue colectado por centrifugación y disuelto en regulador de fosfatos pH 7. La muestra se aplicó en una columna de filtración en gel con un límite de exclusión de 25 kDa para eliminar las sales de (NH4)2SO4 (HiPrep 26/10 prepacked desalting, Amersham Biosciences Ltd, UK). Las fracciones con proteína fueron colectadas y concentradas por ultrafiltración utilizando un centricón con una membrana con límite de exclusión de 50 kDa (Millipore Corp., Bedford, Mass.). La muestra se aplicó en una columna de filtración en gel con un límite de exclusión de 200 kDa (Superose 12 prep grade Amersham Biosciences Ltd, UK).
Purificación de la proteinasa pumAi (intracelular). Las células centrifugadas fueron sometidas a un rompimiento mecánico con perlas de vidrio. El lisado celular fue centrifugado (10 000 X g a 4ºC) y el sobrenadante fue ultracentrifugado (100, 000 X g a 4ºC) para la obtención de la fracción soluble. La muestra fue sometida a una precipitación fraccionada con (NH4)2SO4 al 60 y 80% de saturación. El precipitado fue colectado por centrifugación (12000 X g a 4º C) y disuelto en regulador de fosfatos, pH 7. La muestra fue aplicada en una columna de interacciones hidrofóbicas (Phenyl Superose HR 5/5 Amersham Biosciences Ltd, UK) las proteínas fueron eluidas utilizando un gradiente lineal de 1.7 a 0 M de (NH4)2SO4. Las fracciones con actividad fueron colectadas y aplicadas en una columna HiPrep 26/10 prepacked. Las fracciones con proteína se aplicaron en una columna de interacciones aniónicas (Mono Q HR 5/5 Amersham Biosciences Ltd, UK) las proteínas fueron eluidas utilizando un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl. Finalmente las fracciones con actividad de pumAi fueron aplicadas en una columna de filtración en gel Superose 12 prep grade.
Purificación de la aminopeptidasa pumAPE. La fracción soluble fue obtenida como se describió anteriormente y de igual forma que para la proteinasa pumAi, fue sometida a los mismos pasos de precipitación fraccionada con (NH4)2SO4, pero en este caso el precipitado fue disuelto en regulador de Tris-HCl, pH 8 y aplicado en una columna HiPrep 26/10 prepacked. Las fracciones con proteína fueron aplicadas en una columna de interacciones aniónicas (Q Sepharose HP XK50 Amersham Biosciences Ltd, UK) las proteínas fueron eluidas utilizando un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl. Las fracciones con actividad fueron aplicadas en una columna de interacciones hidrofóbicas Phenyl Superose HR 5/5. Las proteínas fueron eluidas utilizando un gradiente lineal de 1.7 a 0 M de (NH4)2SO4. Las fracciones con actividad de pumAPE fueron concentradas utilizando un centricón con una membrana con un límite de exclusión de 50 kDa, finalmente esta muestra fue aplicada en una columna de filtración en gel Superose 12 prep grade.
Caracterización bioquímica de las proteasas purificadas. La determinación del PM, punto Isoeléctrico, pH y temperatura (estabilidad y óptimos), efecto de inhibidores de proteasas, efecto de diferentes cationes, especificidad por diferentes sustratos, valores de Km y Vmax fueron determinados como se describe en Mercado-Flores y col. (2003a). Los inhibidores específicos de proteasas son de Böehringer Mannheim (Indianápolis, IN, USA).

Resultados y discusión

Considerando la importancia de las enzimas proteolíticas en la biología de los hongos, y en su capacidad para alterar el sabor de los alimentos, en este trabajo se analizó la producción de las proteasas de U. maydis bajo diferentes condiciones de crecimiento, su localización celular y durante la transición dimórfica de levadura a micelio. No se encontraron diferencias en la producción de estas enzimas en las dos cepas utilizadas, ambas producen proteinasa ácida (pumA), proteinasa básica (pumB), aminopeptidasa (pumAPE) y dipeptidilaminopeptidasa (pumDAP) (Mercado-Flores y col., 2003b).
Las dos cepas de U. maydis secretan una actividad de proteinasa ácida (pumAe) cuando son cultivadas en un medio mínimo con (NH4)2SO4 como fuente de nitrógeno y a valores ácidos de pH (2 a 3), precisamente cuando ocurre la transición de levadura a micelio. Estos resultados sugieren que la producción de la enzima es inducida por el pH ácido del medio como ocurre con las proteasas de otros hongos (Denison, 2000). Cuando se probaron diferentes inhibidores específicos de proteasas sobre un extracto crudo de proteinasa pumAe se observó una parcial inhibición de esta actividad con pepstatina (inhibidor de aspartil proteasas), posiblemente indicando la presencia de una mezcla de enzimas en donde una de ellas es una aspartil proteasa y la otra no, o que la afinidad de la enzima por el inhibidor es baja.
Este basidiomiceto también produce actividad de proteinasa ácida en la fracción intracelular (pumAi), específicamente localizada en la fracción soluble libre de membranas. La síntesis de esta enzima alcanzó los mayores niveles de actividad específica en la fase logarítmica de crecimiento en todos los medios de cultivo utilizados. Esta proteasa probablemente es similar a la proteasa yscA de Saccharomyces cerevisiae la cual es una endopeptidasa vacuolar que participa en la degradación de proteínas, en el metabolismo nitrogenado y en procesamiento de precursores (Suárez-Rendueles y Wolf 1988). A diferencia de la proteinasa pumAi, esta actividad fue inhibida totalmente por la pestatina indicando que es una aspartil proteasa.
Cuando este inhibidor fue adicionado al medio de cultivo para la inducción de la transición de levadura a micelio inducida por pH, se observó una disminución en la filamentación y en la actividad específica tanto de la actividad de pumAe como en la de pumAi, sugiriendo la participación de una aspartil proteasa ya sea intracelular o extracelular durante el fenómeno del dimorfismo en U. maydis (Mercado-Flores y col., 2003b).
La proteinasa pumAe fue purificada hasta homogeneidad, dando como resultado una preparación enzimática con 20 mU de actividad. El rendimiento final fue de 7.7% y la enzima se purificó 15.1 veces. La proteasa resultó ser un monómero con un peso molecular de 72 y 74 kDa estimado por filtración en gel y SDS-PAGE respectivamente. La enzima no fue inhibida por ninguno de los inhibidores probados, indicando que es una proteasa ácida extracelular no aspartil. Otras proteasas producidas por otros hongos y que son del mismo tipo (Aspergillus niger var. macrosporus, Scytalidium lignicolum, y Sclerotinia. sclerotiorum), tienen pesos moleculares menores (20, 21.5 y 20.7 kDa, respectivamente) (Takahashi y col., 1991; Kakimori y col., 1996; Poussereau y col., 2001a).
La proteinasa pumAe presentó un pI de 5.5 y fue estable en un amplio intervalo de pH (2.0 a 8.0) durante 12h a 4ºC, además fue activa a valores de pH ácidos (2.0 a 5.0) con un óptimo a pH 4.0 La enzima fue estable por 60 min en un intervalo de 5 a 40º C con un óptimo a 45ºC. pumAe degradó la albúmina a pH 4.0 pero no a pH 5.0, también mostró actividad sobre la hemoglobina y la gelatina aunque ésta última se hidrolizó mejor a pH 5.0. No se observó actividad sobre estos sustratos a pH 7.0. La proteinasa pumAe no degradó la caseína ni la colágena.
La proteinasa pumAe presentó un valor de Km de 3.5 µM y una Vmax de 11430 µmol.h-1.mg-1 sobre el sustrato Suc-R-P-F-H-L-L-V-Y-MCA (Mercado-Flores y col., 2003a).
Los hongos fitopatógenos emplean diversas estrategias para infectar a su planta huésped. Se ha propuesto que los niveles en la producción de proteasas reflejan la adaptación del hongo ya sea a su estado saprofítico o patogénico según los requerimientos de su nicho ecológico (St Leger y col., 1997). La producción y el papel de la proteasas extracelulares en hongos fitopatógenos ha sido investigado en pocos sistemas (Movahedi y Heale, 1990; Ball y col., 1991; Urbanek y Yirdaw, 1984). El fitopatógeno S. sclerotiurum produce dos actividades proteolíticas ácidas extracelulares, una no aspartil y la otra aspartil, la cuales se expresan durante los procesos de infección (Poussereau y col., 2001a; Poussereau y col., 2001b). Es posible que la proteinasa pumAe esté relacionada con los eventos de fitopatogénesis del hongo y además sea una enzima con diferentes características bioquímicas.
La proteinasa pumAi de U. maydis FB1 fue purificada hasta homogeneidad, obteniéndose una preparación enzimática con 85 mU de actividad. El rendimiento final fue de 6.8% y la enzima fue purificada 90.2 veces.
La proteinasa pumAi presentó un peso molecular de 35.3 y 36.6 kDa estimado por filtración en gel y SDS-PAGE respectivamente, sugiriendo que la enzima es un monómero. Otras aspartil proteasas intracelulares de otros hongos presentan pesos moleculares similares tal es el caso de; S. cerevisiae (41.7 kDa), Aspergillus níger (39 kDa), Neurospora crassa (42.9 kDa) y Coccidiodes immitis (45 kDa) (Meussdoerffer y col., 1980; Reichard y col., 2000; Vazquez-Laslop y col., 1996; Jonson y col., 2000). El pI de la enzima purificada fue de 5.5 y además fue estable únicamente a valores de pH ácidos (3.0-6.0) durante 12 horas a 4ºC, siendo activa en este mismo intervalo con un óptimo a pH 4.0. Debido a que la enzima es estable a valores de pH ácidos, la localización de esta actividad podría estar asociada a la vacuola, en donde el mantenimiento del pH ácido es indispensable para las funciones de este organelo (Klionsky y col., 1990). La proteasa fue estable desde 5.0 a 40º C siendo más activa entre 35 y 45º C con una temperatura óptima de 40º C.
La proteinasa pumAi degradó la gelatina, la albúmina, la caseína y la hemoglobina a valores de pH de 4.0, 5.0 y 7.0, siendo más eficiente a pH 5 para los tres primeros sustratos y a pH de 4.0 para la hemoglobina. La enzima no presentó ninguna actividad cuando fue incubada en presencia de colágena (HPA) como sustrato.
Se midió el efecto de inhibidores específicos de proteasas sobre la actividad de la proteinasa pumAi, la cual fue completamente inhibida por la Pestatina indicando que esta enzima pertenece a la familia de las aspartil proteasas. Esta enzima podría estar relacionada con el dimorfismo del hongo e indirectamente con la patogénesis del mismo, ya que al adicionar la pepstatina al medio para la inducción de la transición dimórfica se inhibe la filamentación y disminuye la actividad específica de la proteinasa pumAi (Mercado-Flores y col., 2003b).
Los resultados presentados, muestran la existencia de actividad de proteinasa pumB en la fracción intracelular. A diferencia de la proteinasa pumAi, esta enzima es detectada después de la incubación de los extractos enzimáticos a pH 5 durante 12 h a 4ºC , esto podría ser debido a la presencia de un inhibidor endógeno que regula su actividad (Schu y col., 1991).
Tomando en cuenta los resultados anteriores, se realizó la obtención de un extracto crudo de inhibidor y se probó sobre la actividad de pumBi, encontrándose que a mayor concentración del inhibidor disminuye la actividad de la enzima (Figura 4-B). Estos mismos resultados han sido descritos para la levadura S. cerevisiae (Magni y col., 1986).
El estudio cinético de la producción de pumB mostró que las dos cepas de U. maydis producen esta actividad en las fracciones intracelular (pumBi) y extracelular (pumBe), ésta última alcanzó los mayores niveles de actividad específica en medios mínimos que contenían sulfato de amonio e infusión de maíz como fuentes de nitrógeno. La proteinasa pumBi fue más abundante en la fase estacionaria de crecimiento en medio YNB con sulfato de amonio y en la fase logarítmica de crecimiento en medio YNB con infusión de maíz, además se encontró asociada principalmente a la fracción soluble libre de membranas.
La actividad de la proteinasa pumB no parece tener realación con los eventos de transición dimórfica del hongo (Mercado-Flores y col., 2003b).
La actividad de aminopeptidasa pumAPE se encontró en la fracción intracelular asociada principalmente a la fracción soluble. Los mayores niveles de actividad específica se alcanzaron en la fase logarítmica de crecimiento en todos los medios de cultivo utilizados. Los geles de actividad revelaron la presencia de al menos dos bandas de actividad en las dos cepas de U. maydis utilizadas en este trabajo (Mercado-Flores y col., 2003b).
La aminopeptidasa pumAPE de U. maydis fue purificada hasta homogeneidad, dando como resultado la obtención de una preparación enzimática con 1896 mU. El rendimiento final fue de un 23% y la enzima fue purificada 69.3 veces.
El peso molecular de la enzima estimado por SDS-PAGE fue de 58 kDa aproximadamente, mientras que por filtración en gel fue de 114.4 kDa, estos resultados sugieren que la proteasa purificada es dimérica.
La enzima presentó un pI de 5.1, además mostró actividad en un reducido intervalo de pH (7.0-9.0) con un óptimo a pH 7.0. La actividad fue estable a valores de pH alcalinos (9.0-11.0) durante 12 horas a 4ºC y fue inestable a valores de pH ácidos. La localización celular de esta enzima aún no es clara, su inestabilidad a condiciones ácidas sugiere que pumAPE esta localizada en el citoplasma y no en la vacuola donde se presentan condiciones de pH ácido (Klionsky y col., 1990). La enzima fue activa desde 25 a 45ºC con un óptimo a 35ºC.
La aminopeptidasa pumAPE fue inhibida totalmente por la 1-10, fenantrolina, y EDTA-Na2, indicando que la enzima purificada es una metaloproteasa. La bestatina (inhibidor de exopeptidasas), el pefabloc, el PMSF (inhibidores de serín proteasas) y la leupeptina (inhibidor de cisteín y serín proteasas) mostraron un efecto inhibitorio sobre pumAPE, mientras que la pepstatina (inhibidor de aspartil proteasas) y el E-64 (inhibidor de cisteín proteasas) no mostraron ningún efecto sobre la actividad enzimática. La presencia de Cu2+, Hg2+ y Zn2+ causan la inhibición total de la actividad enzimática pumAPE. Otros cationes como Co2+, Ni2+ y Mn2+ mostraron una fuerte inhibición, al igual que la presencia Mg2+ y Ca2+, aunque el efecto de éstos últimos fue menor comparado con el de los anteriores. No se observó ningún efecto estimulatorio sobre la aminopeptidasa pumAPE con ninguno de los cationes probados.
La aminopeptidasa pumAPE presentó un valor de Km de 350 µM y una Vmax de 2.49 µmol.h-1.mg-1 a pH 7.0 y a 370C sobre el sustrato Lys-4-NA.
La enzima purificada mostró una mayor preferencia por Lys-4-NA, indicando que la proteasa es una Lisin-aminopeptidasa. El orden de preferencia de la enzima por el aminoácido que ocupa la posición del extremo amino terminal fue el siguiente: lisina, arginina, alanina, leucina, metionina, prolina y fenilalanina. No se observó actividad sobre sustratos que contenían dos aminoácidos en la posición del extremo amino.
En U. maydis el gen rep1 es expresado abundantemente durante el desarrollo del micelio aéreo. Este gen codifica para una proteína de 652 aminoácidos, la cual es procesada en 11 péptidos pequeños relacionados en secuencia, los cuales, son secretados y localizados en la pared celular en donde se encargan de la adherencia de la hifa a las superficies hidrofóbicas. Esta función podría ser importante durante la interacción planta-hongo fitopatógeno. Específicamente el péptido 1-4 recibe un tratamiento proteolítico en donde una lisina es removida a partir del extremo amino terminal, esta acción podría llevarse a cabo por lisin aminopeptidasa (Wösten y col., 1996). Probablemente pumAPE tiene un papel importante en la producción de este péptido hidrofóbico y podría participar indirectamente durante la interacción planta-patógeno.
U. maydis produce actividad de dipeptidilaminopeptidasa pumDAP en la fracción intracelular. Los mayores niveles de actividad específica fueron alcanzados en la fase estacionaria tardía de crecimiento en medio YNB con prolina y en la fase logarítmica en medio YNB con infusión de maíz, este efecto estimulatorio por la infusión de maíz es interesante y es posible especular que la pumDAP participe durante la interacción del hongo con su huésped.
La dipeptidilaminopaptidasa pumDAP se encontró tanto en el crecimiento micelial como en el levaduriforme, sin diferencias significativas en su actividad específica indicando que esta enzima no esta implicada en el dimorfismo del hongo (Mercado-Flores y col., 2003b).
Las dipeptidil aminopeptidasas microbianas juegan un papel importante en la generación de sabores de alimentos lácticos y embutidos (Bolumar y col., 2003; Bintsis y col., 2003).

Conclusiones

1. U. maydis produce una proteinasa ácida no aspartil extracelular (pumAe) con un PM de 72 kDa relacionada con el dimorfismo del hongo, por lo tanto probablemente con el establecimiento de la infección del maíz y formación del “huitlacoche”.
2. U. maydis produce una proteinasa ácida aspártica intracelular (pumAi) con un PM de 35 kDa probablemente vacuolar y relacionada con el metabolismo nitrogenado del hongo.
3. U. maydis produce una aminopeptidasa intracelular (pumAPE) dimérica, con un PM de 58 kDa para el monómero. Esta metaloproteasa pudiera madurar otros péptidos o proteínas.
4. U. maydis produce además una proteinasa B intracelular (pumB) regulada por su inhibidor endógeno, así como una dipeptidil aminopeptidasa (pumDAP), enzima presente en microorganismos de alimentos lácticos y cárnicos que generan aminoácidos y péptidos responsables del sabor.