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La biología molecular nos ha brindado durante las últimas décadas, información importante de cómo transferir unidades específicas de información genética de un organismo a otro (Osuna y Paredes – López, 2001; Uzogara, 2000). Este movimiento de genes se basa en las técnicas de ingeniería genética también conocida como Tecnología del DNA Recombinante. La biotecnología moderna, nos ha brindado una serie de avances tecnológi-cos en las áreas farmacéutica, médica y alimenticia. Uno de los logros más importante de la biotecnología agrícola es el desarrollo de cultivos transgénicos. En la actualidad los cultivos transgénicos más importantes son soya, papa, canola, algodón, trigo, arroz, y maíz. Las características incorporadas con mayor frecuencia en estos cultivos, son la resistencia a insectos, la tolerancia a herbicidas y la resistencia a enfermedades virales y bacterianas, lo que ha permitido evitar la aspersión de una cantidad considerable de toneladas de insecticidas y agroquímicos (Osuna y Paredes – López, 2001; Uzogara, 2000, Hileman, 1995). Es-pecíficamente, el maíz Bth con genes de la bacteria Bacillus thuringiensis resiste al ataque de insectos “barrenador” (Ostrinia nubilabis). La resistencia la produce la proteína codificada por el gen (Cry). Esta proteína es capaz de unirse a receptores específicos del tubo digestivo de los insectos, interfiriendo en su alimentación y causando su muerte. Para obte-ner una mayor producción de ésta proteína, se requiere de un promotor, el más utilizado es el CaMV 35 S, proveniente del virus que causa la enfermedad del mosaico de la coliflor (Galum and Breiman, 1998); Sin embargo, existe controversia sobre los riesgos en el con-sumo de estos productos por el humano, tales riesgos pueden ser la presencia de alergias, o bien, que las bacterias del tracto intestinal animal y humano puedan incorporar directa o indirectamente la información genética contenida en los alimentos transgénicos, el riesgo se incrementa cuando se utilizan como marcador genético genes que produce resistencia a antibióticos (Browaeys, 1997). En este aspecto hay que mencionar que no hay evidencia científica alguna de que ello pueda ocurrir en la práctica aunque fuera teóricamente posible.
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Metodología
Este trabajo de investigación se dividió en cuatro etapas:
A. Determinación de la Presencia de Genes Transgénicos en Plántulas de Grano de Maíz Importado, la cual se realizo de la siguiente manera:
1.Obtención del material vegetal: Se sembraron granos de maíz importado de E.U.A. en macetas con capacidad de 1 kg, las macetas se regaron diariamente y se incubaron a 22 °C durante 10 días, al cabo de este tiempo se colecto el tejido vegetal (hojas).
2.Extracción de DNA del Tejido Vegetal: Antes de iniciar esta etapa, se realizó la este-rilización del área de trabajo, así como los equipos (baño maría, microcentrifugadora y micropipetas) y materiales a utilizar (morteros, microtubos de 1.5 mL, puntillas y guantes de látex) con la finalidad de eliminar la probabilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos. Posteriormente se llevó a cabo la extracción de DNA modificando la técnica (CTAB) reportada por Graham, et al. en 1994.
3.Calidad de DNA del Tejido Vegetal: La verificación de la calidad de DNA, se realizo por electroforesis en geles de agarosa al 1%.
4.PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): Se llevo a cabo esta técnica para identificar la presencia de las secuencias trangénicas del gen Cry con los primers: Cry1Ab y Cry1As; y del promotor CaMV con los primers: 35S1 y 35S2, para cada una de las muestras se utilizo una mezcla que contenía agua destilada desionizada estéril, buffer 10X, MgCl2, dNTP’S, la enzima TaqPolimerasa, los primers respectivamente y el DNA de la muestra a analizar. Para la amplificación de los segmentos transgénicos se utilizo un Termociclador (Ampriton II Thermolyne) con 35 ciclos. En ambos casos la temperatura de desnaturalización fue de 94 y la temperatura de elongación fue de 72, y la temperatura de apareamiento de 62 y 52 para los primers Cry y 35 S respectivamente. El tiempo en cada etapa del ciclo de PCR fue de 1 minuto. Al término de la reacción, se realizó la electroforesis en gel de agarosa 1% con el propósito de observar los segmentos amplificados de las muestras, 184 pb y 252 pb; respectivamente, utilizando los marcadores moleculares Ladder 123 y Ladder 100 como referencia para el tamaño de los segmentos amplificados.
B. Aislamiento del DNA de Alimentos Tradicionales Mexicanos, el cual consistió en lo siguiente:
1.Elaboración de los Productos Alimenticios a partir de Maíz Transgénico: Después de verificar la presencia de segmentos transgénicos en las muestras de maíz, se elaboraron de forma tradicional diferentes productos con este maíz transgénico, los alimentos tradicionales elaborados fueron: tamal, tortilla, pinole, frito y atole, estos se seleccionaron por los diferentes tratamientos a los cuales se someten para su elaboración.
2.Determinación de los Puntos Críticos de los Productos elaborados: En cada producto elaborado se determinaron las etapas críticas de acuerdo a los cambios físicos y químicos a los que se sometía cada alimento, las etapas criticas se describen a continuación:
•Nixtamalización: reposo de la nixtamalización y molienda.
•Tamal: formación de la masa y cocción.
•Tortilla: troquelado y cocción en comal.
•Frito: deshidratación y cocción.
•Atole: suspensión de la mezcla.
•Pinole: tostado y molienda.
3.Extracción de DNA: Se realizó la extracción de DNA de la alimento en cada una de las etapas de elaboración, para esto se emplearon dos técnicas, la técnica CTAB y con un kit comercial (QIAamp DNA Stool Mini).
4.Calidad de DNA de los productos tradicionales mexicanos: se verificó la calidad de DNA de los productos típicos mexicanos, así como también durante sus diversas etapas, en geles de agarosa al 1% mediante electroforesis.
C. Evaluación del Grado de Degradación del DNA Transgénico Durante las Etapas de Elaboración de Alimentos Tradicionales Mexicanos. El procedimiento a seguir en esta etapa fue el siguiente:
1.PCR del DNA de los Productos Elaborados con Maíz Transgénico: se realizó la técnica de PCR para identificar la presencia del gen Cry con los primers: Cry1Ab y Cry1As, y del promotor CaMV con los primers: 35S1 y 35S2 de acuerdo a la relación mencionada anteriormente. Así mismo se realizaron diferentes diluciones del DNA ex-traído (1:10, 1:20 y 1:50), esto se hizo, con el fin de eliminar inhibidores que pudieran afectar la PCR. Por otra parte, se realizó la técnica de PCR utilizando combinaciones de los cuatro primers (Cry1Ab – 35S1, Cry1Ab – 35S2, Cry1As – 35S1 y Cry1As – 35S1) empleando el procedimiento ya descrito. La visualización de los segmentos amplificados se realizó por electroforesis de geles de agarosa al 1%.
D. Determinación del Efecto del pH y Temperatura sobre la Estabilidad de los Segmentos de DNA, el cual consistió en lo siguiente:
1.Determinación de pH: en cada una de sus etapas críticas descritas anteriormente.
2.Determinación del tiempo y temperatura de cocción: en cada una de las etapas de los productos elaborados.
3.Correlación de la presencia de segmentos amplificados: con el pH, tiempo y temperatura de cocción del alimento.
Resultados y Discusión
A. Determinación de la Presencia de Genes Transgénicos en Plántulas de Grano de Maíz Importado
En el DNA aislado de las plantas de maíz; se observaron bandas gruesas e intensas, lo cual indica que se trata de un DNA de alto peso molecular y no degradado. Con base en lo anterior, se procedió a realizar la técnica de PCR para la identificación del gen Cry y del promotor CaMV. En la figura 1, se observan bandas intensas amplificadas del gen Cry con un total de 184 pb (pocillos 1 y 3). Además se observaron bandas amplificadas de 123 pb con el promotor CaMV. En este caso las bandas fueron menores a las reportadas de 252 pb. Por Stram, et al. quienes en el año 2000, consignan la presencia de secuencias del promotor CaMV en chuletas de pavo empanizadas, preparadas con harina de soya genética-mente modificada. Encontrando en los productos analizados bandas de 252 pb del promotor CaMV. Cuando se obtienen bandas menores a lo estipulado, se recomienda hacer lo si-guiente: incrementar la temperatura de apareamiento; el tiempo de apareamiento; el tiempo de extensión; la temperatura de extensión a 74 – 78°C; disminuir la concentración del buf-fer KCl a 0.7 – 0.8 M, pero manteniendo la concentración del MgCl2 a 1.2 – 2.0 mM; incrementar la concentración del MgCl2 a 3.0 – 4.5 mM, pero manteniendo la concentración de los dNTP’s constantes; o bien, añadir menos primer, DNA ó la enzima TaqPolime-rasa; así como también checar la secuencia de los primers utilizados (htttp:/info.med.yale.edu/genetics/ward/tavl/Trblesht.html).
Por otra parte, los resultados del gen Cry fueron comparados con los estudios que realizaron Tengel, et al. en el año 2001, quienes identificaron la presencia de genes trans-génicos de soya (EPSPS) y maíz (Cry1Ab) en productos elaborados; algunos de los produc-tos analizados fueron: harina de soja, tofu, proteína de soja, harina de maíz, cereal de cho-colate y taco shells, donde se obtuvieron segmentos amplificados del gen EPSPS 356 pb en productos de soja; y en los productos elaborados con maíz obtuvieron segmentos del gen Cry 184 pb; confirmando la existencia de genes transgénicos en los productos elaborados.
B. Aislamiento de DNA de Alimentos Tradicionales Mexicanos
Con el método CTAB y con el kit QIAamp DNA Stool Mini se extrajeron muestras de DNA de los productos elaborados y de muestras de sus etapas críticas; sin embargo, aunque se hicieron ambas pruebas se obtuvieron mejores resultados con el método de CTAB, ya que se observaron bandas intensas, indicando un DNA de alto y bajo peso mole-cular. En la figura 2 se observan bandas de DNA de muy buena calidad (Valadez, 2000), en los pocillos 1, 5 y 10 mientras que en los pocillos 2, 3, 4, 7 y 11 se obtuvieron bandas leves. Con el kit utilizado se presentaron interferencias ya que el almidón impedía el proceso de la extracción de DNA, excepto con el atole (Figura 3). En la figura 3, se muestran las bandas obtenidas de la muestra de atole, extraídas con el método CTAB y con el kit QIAamp DNA Stool Mini Kit. De acuerdo a las bandas obtenidas, las muestras serían acep-tables para llevar a cabo la reacción en la cadena de la polimerasa y lograr la amplificación de los segmentos buscados.
C. Evaluación del Grado de Degradación del DNA Transgénico Durante las Etapas de Elaboración de Alimentos Tradicionales Mexicanos
Una vez obtenido DNA de buena calidad, se realizó la técnica de PCR para la iden-tificación de la presencia de secuencias transgénicas en los alimentos elaborados con maíz. Se ha reportado que factores físicos y químicos degradan el DNA, durante alguna etapa del proceso de elaboración del alimento; dichos factores son: temperaturas altas, pH y actividades enzimáticas (Wurz, et al. 1999; Hupfer, et al. 1998). Posteriormente, se observaron los segmentos amplificados de las muestras de los productos analizados por medio de electroforesis de geles de agarosa al 1%. En la figura 4, se observan bandas intensas obtenidas de los alimentos elaborados (tamal, tortilla, frito y pinole) en su etapa final, donde se amplificaron segmentos de 184 pb del gen Cry (Tengel, et al. 2001). Sin embargo, con el atole se amplificaron segmentos menores de 125 pb (Figura 5). En la figura 5 y 6, se lograron am-plificar segmentos menores de 123 pb con el promotor CaMV, en tamal, tortilla y atole; mientras que en el frito y pinole se obtuvieron bandas de 123 pb.
Estos segmentos representan casi la mitad de los segmentos del promotor, amplificados en estudios previos (Stram, et al. 2000). Asimismo, se realizó la técnica de PCR utilizando combinaciones de los cuatro primers, obteniendo los siguientes juegos: 1 Cry1Ab – 35S1; 2 Cry1Ab – 35S2, 3 Cry1As – 35S1 y 4 Cry1As – 35S1). En la figura 7, se observa la amplificación de segmentos obtenidos de las combinaciones de los cuatro primers. Con el juego 1, se lograron amplificar segmentos de 123 pb en tamal, tortilla, frito y pinole; con el juego 2, se amplificaron bandas menores de 123 pb en el tamal y tortilla, mientras que en el frito y pinole se obtuvieron 123 pb; con el juego 3, se amplificaron segmentos de 123 pb en tortilla, frito y pinole, en el caso del tamal se amplificaron bandas menores de 123 pb; por último con el juego 4, se observaron segmentos amplificados de 123 pb en el tamal, tortilla y frito, mientras que en el pinole se observan bandas de 250 pb.
De acuerdo a los resultados descritos anteriormente, se apreció que el segmento del gen Cry (184 pb) permaneció sin degradarse durante las etapas de elaboración de los pro-ductos analizados (tamal, tortilla, frito y pinole) soportando tratamientos altamente alcalinos; sin embargo, con el promotor CaMV solamente se lograron amplificar segmentos cortos (123 pb) en todos los productos.
La identificación de secuencias transgénicas en alimentos, sugiere que estas secuen-cias permanecen intactas hasta la etapa final del producto, sin verse afectada por los trata-mientos térmicos ni por pH alcalinos; ya que la hidrólisis del DNA resiste a soluciones alcalinas (Hupfer, et al. 1998); sin embargo al parecer en las secuencias largas (252 pb) ocu-rre una degradación del DNA, amplificando solamente segmentos cortos de la secuencia; lo cual sugiere que los segmentos largos son mas fácilmente degradados por los procesos tér-micos, y soluciones con pH ácido (Hupfer, et al. 1998).
D. Determinación del Efecto de pH y Temperatura Sobre la Estabilidad de los Seg-mentos de DNA
Se midió el pH y la temperatura en cada una de las etapas criticas de elaboración de los productos, con la finalidad de determinar si estos factores afectan la degradación del DNA transgénico en la elaboración de alimentos tradicionales mexicanos. Tengel, et al. 2001 indican que el DNA se degrada en los alimentos que se someten a procesos muy drásticos.
Relacionando lo anterior con la amplificación de los segmentos transgéncios en los productos mexicanos se aprecia que el DNA de bajo peso molecular <250 pb resiste a las soluciones alcalinas; así como también a tratamientos térmicos empleados en la elaboración de tortilla, tamal, frito, atole y pinole. Sin embargo, el DNA de secuencias largas >250 pb es más susceptible a degradarse en la elaboración de alimentos, al parecer debido al efecto de pH ácidos, ya que existe una descomposición de los enlaces N - glucosídicos entre los residuos de la deoxirribosa y bases y por consiguiente son hidrolizadas las uniones del 3’ – 5’ fosfodiester (Hupfer et al. 1998).
Conclusiones
- Las muestras analizadas de maíz importado se certificaron como genéticamente modifi-cadas, ya que en su DNA contiene una secuencia del gen Cry (184 pb), proveniente de la bacteria Bacillus thuringiensis y del promotor del CAMV.
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Se logro aislar DNA de los productos elaborados tortillas, tamal, atole, pinole y frito y de sus etapas de elaboración intermedias.
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Los tratamientos a los que se someten los alimentos tradicionales durante su elabora-ción, no provocaron la degradación del DNA de secuencias cortas como la del gen Cry (184 pb); sin embargo, existe una desnaturalización de secuencias largas mayores a 250 pb.
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En tamal, tortilla, frito, pinole y atole se logró identificar la presencia del gen transgéni-co: Cry y del promotor CaMV, obteniendo segmentos amplificados de DNA menores a 250 pb.
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pH ácido degradan secuencias largas mayores a 255 pb; mientras que en pH básicos son más resistentes secuencias cortas como la del gen Cry (184 pb).
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